摘要：近年來，由于醫(yī)藥、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中抗生素的過度使用和誤用，致使細菌耐藥性和食品藥物殘留等問題日益突出。據(jù)統(tǒng)計，若2014到2050年間不采取任何措施來解決抗生素濫用和細菌耐藥性發(fā)展的趨勢，估計有3億人會因抗藥性而過早死亡，導致60~100萬億美元的經(jīng)濟損失［1］。由于耐藥病原體的數(shù)量逐漸增多，迫切需要新的抗菌藥代替現(xiàn)有抗生素�？咕模╝ntimicrobial peptides，AMPs）作為防御微生物的有效武器，因其廣譜的抗菌活性、獨特的作用機制和罕見的抗生素抗性變體（antibiotic-resistant variants）特性而備受關(guān)注（見圖1）。AMPs是細菌、昆蟲、植物和脊椎動物等幾乎所有生物體先天免疫的一部分，除了抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性外，對細菌、真菌、寄生蟲、原蟲和病毒等具有廣譜抗菌活性，且對癌細胞具有細胞毒性。
近些年，AMPs在治療皮膚感染、血管生成、炎癥反應、細胞信號轉(zhuǎn)導、創(chuàng)面愈合、局部和全身適應癥方面的研究取得了實質(zhì)性進展［2-4］。AMPs最先發(fā)現(xiàn)于1939年，研究人員從芽孢桿菌（Bacillus brevis）中提取了克拉霉素（短桿菌肽Gramcidin），然后在1981年分離出天蠶素（Cecropin）和Magainin［2］。脊椎動物抗菌肽最早于20世紀80年代中期在兩棲動物、人和家兔中發(fā)現(xiàn)，魚類AMPs雖在同一時期被發(fā)現(xiàn)，但卻直到1996年才首次檢測到其具有抗菌活性［5］。AMPs通常被認為是先天免疫的重要組成部分，是抵御多種病原體的第一道防線。AMPs的二級結(jié)構(gòu)是它攻擊病原菌的關(guān)鍵因素，其二級結(jié)構(gòu)可大致分為4類，其中有α-螺旋，含2個或多個二硫鍵的β-直鏈，存在單個二硫鍵和或肽鏈環(huán)化β-折疊，伸展的肽鏈。AMPs都是陽離子型或兩親性的，大多數(shù)AMPs都能破壞細菌細胞膜，使內(nèi)容物泄漏，出現(xiàn)空泡化。AMPs通過破壞細胞膜迅速殺死入侵的病原體，使病原體很難產(chǎn)生耐藥性。AMPs能夠與細菌DNA、RNA結(jié)合來抑制蛋白質(zhì)合成，并導致細菌死亡。某些AMPs可以通過抑制細胞的呼吸作用和與細菌的熱休克蛋白結(jié)合發(fā)揮抗菌活性［3］。魚類經(jīng)常受到各種病原體的挑戰(zhàn)，這些病原體不僅對魚類的健康有害，且增加了它們對傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生耐藥性的風險。由于魚類更依賴先天免疫，所以魚類AMPs可以作為潛在的防御武器對抗新出現(xiàn)的毀滅性感染性疾�。�6］。
本文對魚類AMPs的分類、結(jié)構(gòu)特征、抗菌譜及作用機制、分子設(shè)計等研究進展進行綜述，以期為更好地將其用于漁業(yè)生產(chǎn)和防病治病，開發(fā)綠色環(huán)保養(yǎng)殖技術(shù)，促進養(yǎng)殖漁業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。
1 魚類AMPs分類
AMPs是一大類具有獨特結(jié)構(gòu)的生物分子，通常含有12到50個氨基酸殘基，由于分子中包含2個或者更多的帶正電的氨基酸殘基，如精氨酸、賴氨酸，或者在酸性環(huán)境中的組氨酸，且疏水結(jié)構(gòu)域一般超過50%，可以基于其氨基酸組成和結(jié)構(gòu)進行分類，根據(jù)已知魚類AMPs的分類、結(jié)構(gòu)特征、表達部位等信息見表1，按照不同類型AMPs抗菌譜整理成表2。
Piscidin含18~26個氨基酸，呈α-螺旋，具有高度保守的氨基末端，富含組氨酸和苯丙氨酸。首次于雜交條紋鱸魚［hybrid striped bass （Morone saxatilis × M. chrysops）］的肥大細胞中分離得到，Piscidin具抗真菌、抗寄生蟲和抗病毒活性［8-9］。此外，在同一物種中還發(fā)現(xiàn)了多種Piscidin亞型，主要在鰓、皮膚和腸中表達，也在頭、腎和脾中表達［5，10］。
Defensin由18~45個氨基酸組成，含6~8個保守的半胱氨酸，對細菌、真菌和許多包膜病毒和非包膜病毒都有一定的抗菌活性，根據(jù)半胱氨酸形成二硫鍵的配對和定位不同將其分為α-，β-，θ-Defensin 3類［11］。目前已發(fā)現(xiàn)該抗菌肽的4個基因和5個亞型，主要在頭、肝、眼、性腺、肌肉和皮膚等部位表達［5，12］。
Hepcidin的前肽含有85個氨基酸殘基，由3個部分組成：信號肽（24個氨基酸）、前肽（40個氨基酸）和成熟肽（21個氨基酸），該基因有2個內(nèi)含子和3個外顯子［13］，主要在肝臟中表達。Hepcidin作用廣泛，對革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌均有活性，具有抗病毒、抗寄生蟲、免疫調(diào)節(jié)、抑制真菌和酵母生長等作用［13-14］。同時，Hepcidin作為鐵調(diào)節(jié)激素，還控制巨噬細胞和肝細胞的鐵釋放，限制鐵釋放到血漿中的量［15］。
Cathelicidin含12~80個氨基酸不等，其中由23~37個氨基酸組成的肽呈線性肽鏈，折疊形成兩親性的α-螺旋；12~18個氨基酸的肽鏈形成具有二硫鍵的β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)；39~80個氨基酸組成的肽鏈顯示重復的脯氨酸基序，形成擴展的多脯氨酸型結(jié)構(gòu)［16］。Cathelicidin對細菌、原生動物、真菌和病毒都有一定的抑制作用，在鰓、頭腎、腸道、皮膚和脾等部位表達［16-18］。Cathelicidin首次在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)是從大西洋海鰻（Myxine glutinosa）的腸道中分離出了3種有效抗菌肽（HFIAP-1，-2和-3），然后在被細菌感染的虹鱒（Oncorhynchus mykiss）中也發(fā)現(xiàn)了Cathelicidin的表達［18］。
Pardaxin含33個氨基酸殘基，是從紅海比目魚（Pardachirus marmoratus）的毒液中分離出來的多肽神經(jīng)毒素，具有螺旋-鉸鏈-螺旋結(jié)構(gòu)�？赏ㄟ^裂解細菌壁來抑制細菌生長，此外，還能抑制腫瘤細胞系的增殖，誘導細胞凋亡［19-20］。
2 影響AMPs活性的因素
AMPs的陽離子性質(zhì)使其能夠通過靜電吸引與微生物相結(jié)合，或者在吞噬細胞攝取微生物后增強其殺滅作用。當AMPs在微生物表面積累達到臨界濃度時，其疏水面在微生物細胞質(zhì)膜內(nèi)滲透和組裝形成離子通道或水孔，導致微生物低滲透裂解死亡［36］。Lee等［37］測試AMPs抗菌活性的實驗中，天蠶素樣肽C端含有疏水性螺旋，對革蘭氏陰性菌有很高的抗菌活性。Papiliocin對革蘭氏陰性菌的抗菌活性與天蠶素A相似。然而，Papiliocin在N-端螺旋中的凈電荷為+6，而天蠶素A為+5。因此，作者推測Papiliocin含陽離子度更高是Papiliocin對革蘭氏陽性菌的抗菌活性高于天蠶素A的潛在原因。魏曉曉等設(shè)計將牛血紅蛋白源AMPs的第1、2位的Val和Asp都替換為Arg后合成多肽，發(fā)現(xiàn)合成肽的靜電荷比原AMPs凈電荷數(shù)多2，其抑菌活性比原AMPs的高，對紅細胞的滲透脆性影響很小，有較高的安全性。
適當?shù)氖杷钥墒闺膶щ娔ず椭行阅さ挠H和力增加［39］。Chen等［40］通過用疏水性較弱的丙氨酸取代亮氨基或用亮氨酸殘基取代丙氨酸殘基，系統(tǒng)性地降低或增加疏水性，發(fā)現(xiàn)處于疏水性臨界值時抗菌活性最強。在臨界值的一定范圍內(nèi)增強疏水性可提高抗菌能力，但超過或者低于該范圍都會使抗菌活性顯著降低。郝剛［41］在BF2-A第10位精氨酸上接入序列RLLR并用亮氨酸取代第8位上的纈氨酸，設(shè)計合成了一個新肽BF2-X。與BF2-A相比，BF2-X的螺旋度與正電荷增加，疏水性比例提高，C-端兩親性增強。在抗菌活性測試中，BF2-X對大腸桿菌和金葡菌的抗菌活性是BF2-A的兩倍，且殺菌比BF2-A更為快速。
AMPs具有豐富的二級結(jié)構(gòu)，包括由2~3個二硫鍵形成穩(wěn)定的β-折疊、兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)、環(huán)化肽和帶有1~2個氨基酸殘基的延伸肽鏈，通過調(diào)整肽的結(jié)構(gòu)可適當?shù)靥岣呖咕钚裕?］（見圖2）。Wang等［42］為研究AMPs polybia-MPI結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，設(shè)計并合成了由L-Pro分別取代Leu7，Ala8和Asp9的三種類似物。Leu7和Asp9的L-Pro取代物α-螺旋構(gòu)象的含量降低，Ala8的L-Pro取代物徹底破壞了α-螺旋構(gòu)象。L-Pro取代物抗腫瘤活性顯著降低，表明polybia-MPI的α-螺旋構(gòu)象對抗腫瘤活性十分重要。
二硫鍵是比較穩(wěn)定的共價鍵，其形成和還原是局部的、兩態(tài)的，在結(jié)構(gòu)上有明顯變化。二硫化物是穩(wěn)定的共價中間體，其結(jié)構(gòu)可以表征和分離［43］。Bai等［44］對防御素活性與結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)，天然二硫鍵在進化中是保守的，雖然對防御素抗菌作用影響不大，但是有助于肽結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和趨化活性。同時，在其他抗微生物肽中也有類似發(fā)現(xiàn)，如Tachyplesin和polyphemusins等。Lee等［45］采用酶解和質(zhì)譜分析相結(jié)合的方法確定了Coprisin的二硫鍵對，發(fā)現(xiàn)消除Coprisin中任何一對二硫鍵，其抗菌活性都將消失，但抗真菌活性存在。通過圓二色譜（CD）分析表明，Coprisin的2個二硫鍵Cys20-Cys39和Cys24-Cys41穩(wěn)定Coprisin的α-螺旋區(qū)，從而影響其抗菌活性和穩(wěn)定性。
3 AMPs分子的定向改造
在擴大AMPs抗菌譜的研究中，構(gòu)建雜合AMPs是目前應用比較廣泛的技術(shù)（見圖3）。Wang等［46］利用基因拼接技術(shù)將Attacin和Thanatin構(gòu)建成雜合肽Attacin-Thanatin，插入質(zhì)粒pET-32a（+）中，并在大腸桿菌Rosetta中誘導表達。生物活性檢測表明，該肽能有效抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等的生長，且雜合肽對測試細菌的抗菌活性略高于單一的AttacinAMPs，對豬紅細胞幾乎沒有毒性。張宏剛等［47］采用重疊延伸技術(shù)合成抗菌肽Melitti和Mytilin-B的功能序列，得到雜合AMPs Mel-MytB（MEM）。對其表達產(chǎn)物進行測定，雜合肽具有廣譜抗菌活性，對革蘭氏陰性菌和陽性菌都有較強的抑菌活性，同時具有熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性的特點。AMPs數(shù)據(jù)庫篩選與計算機分子設(shè)計為擴大AMPs的抗菌譜提供了新的思路。中東呼吸綜合征（MERS-CoV）在目前尚無有效的治療手段，Mustafa等［48］通過對MERS-CoV的刺突蛋白進行計算機對接研究，根據(jù)特定的理化性質(zhì)從AMPs數(shù)據(jù)庫（APD3）中檢索篩選出合適的AMPs；利用Piper技術(shù)，通過蛋白質(zhì)-肽對接過程中形成的簇數(shù)來測量肽的結(jié)合模式。從而得到可能與MERS-CoV的刺突蛋白結(jié)合的AMPs分子，這些AMPs可能在發(fā)揮抑制作用方面至關(guān)重要。通過對208個聚類大小的分析，得到7個具有良好結(jié)合分數(shù)的假定肽。
在分離、純化等過程中，分子量小且表達產(chǎn)物穩(wěn)定性不高的AMPs易受蛋白酶的影響而降解，多肽固有的代謝降解不穩(wěn)定性是將肽類藥物推向市場的一大難題［49］。殘基取代這一改造方法可顯著地提高AMPs的穩(wěn)定性。在Adam等［50］的研究中，EFK17是取自LL-37具有抑菌活性的肽段。在其蛋白酶切割位點用d-對映體或色氨酸取代，且在末端酰胺化和乙�；玫紼FK17的變體。在酶反應條件下，LL-7及EFK17只有不到20%的肽段未被消化，而被d-對映體取代的EFK17同源物未顯示任何明顯的蛋白水解跡象。截斷也是提高多肽水解穩(wěn)定性的一種途徑。
3.3 提高抗菌活性
AMPs的抗菌活性與其抑制或殺滅病原微生物的能力緊密相關(guān)，宋雪瑩等［51］截取Lactoferricin B AMPs前15個氨基酸，截取多肽與Lactoferricin B有相同的抗菌活性，經(jīng)一系列設(shè)計連接，合成牛乳鐵蛋白素-天蠶素（Lactoferricin B-Cecropin）。抑菌活性試驗表明設(shè)計的雜合肽Lactoferricin B-Cecropin具有更明顯的抗菌活性，且在抑菌濃度范圍內(nèi)幾乎無溶血作用。Kim等［52］合成的雜合AMPs HP-ma的抑菌活性是HP和Magainin的2-32倍，HP-MA對囊泡裂解比HP和Magainin更有效。熒光各向異性法檢測結(jié)果表明HP-MA比Magainin具有更大的膜裂解活性。AMPs在細菌感染等潛在臨床治療中仍存在許多缺點，將其與商業(yè)抗生素結(jié)合使用或許是有效的解決途徑之一。Arenas等［53］采用化學合成了4種AMPs，分別為Pin2［G］、Pin2、P18K和FA1。4種AMPs對單一的微生物具有很好的抑制效果，肽FA1對銅綠假單胞菌抑菌效力最大，Pin2［G］抗金黃色葡萄球菌活性最好。為得到抗菌效果最佳的AMPs，將AMPs與8種商用抗生素（阿莫西林、阿奇霉素、頭孢曲松、慶大霉素、左氧氟沙星、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶和萬古霉素）組合。根據(jù)分級抑菌濃度指數(shù)，F(xiàn)A1與左氧氟沙星和磺胺甲惡唑的組合具有最佳的抗菌效果；FA1或Pin2［G］與其他抗生素的組合表明，這些組合的總抑制作用大于AMPs或抗生素單獨作用的總和。
在開發(fā)AMPs類藥物過程中，AMPs具備天然的優(yōu)良特性，但也存在一定的缺點，除了抗菌活性低外，部分AMPs對細胞還有毒性的影響。Van Dijk等［54］研究了Cathelicidin類AMPs鉸鏈區(qū)的氨基酸被取代后對細胞毒性的影響，發(fā)現(xiàn)雞紅細胞在含40 μmol/L的CATH-2條件下有26％的細胞被裂解。在相同濃度下，甘氨酸取代脯氨酸后的肽引起的溶血減少至10％，而被亮氨酸取代的肽沒有導致溶血現(xiàn)象。Nagarajan等［55］使用最大共同子圖法（maximum common subgraph approach）設(shè)計了AMPs，通過優(yōu)化現(xiàn)有子圖形的疊加來生成新的圖形，以便在新設(shè)計中表示最多的數(shù)據(jù)庫子圖形。設(shè)計得到的最優(yōu)肽為Ω76，重復使用亞致死劑量Ω76處理的小鼠未顯示出慢性毒性的跡象；且在小鼠中對碳青霉烯（Carbapenem）和替加環(huán)素耐藥的鮑曼不動桿菌（tigecycline-resistant Acinetobacter baumannii）表現(xiàn)出較高效力；與亞致死粘菌素劑量同時使用的亞致死W76劑量，無附加毒性。這些結(jié)果表明Ω76具有潛在的補充或替代粘菌素的作用，特別是在腎毒性方面。
4 展 望
AMPs是非常具有潛力的能代替抗生素的蛋白類物質(zhì)，但在作為臨床藥物的開發(fā)過程中存在許多問題亟需解決，首先AMPs類藥物產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高；其次是分子機制和作用機理尚不明確，限制了其作為藥物在臨床的安全使用；第三，兼具高抗菌活性、廣抗菌譜和低毒性等優(yōu)點的新型AMPs還有待進一步研究。未來在以下方面著力有望加速AMPs在生產(chǎn)實踐中的應用。
研究表明［56］，固定化抗體技術(shù)通過以一種正確的空間取向?qū)⒖贵w固定到固相表面，在完全保留抗體構(gòu)象和活性的同時最大化抗體的結(jié)合能力，展現(xiàn)出良好的應用前景。AMPs具有廣譜活性、快速殺菌、生物相容性好和耐藥能力強等優(yōu)點，是一種極具應用前景的固定化材料。開展AMPs表面固定化技術(shù)研究，將其固定在生物膜表面，可以較傳統(tǒng)技術(shù)延長其作用時間和維持有效的作用濃度，也有利于可聚合陽離子（Abominable polycation）的生物相容性問題。同時，固定化肽可以以多種方式影響細菌細胞，從基因組重編程（genome reprogramming）到細菌死亡。提高對固定化AMPs抗菌效果及作用機制的研究，對優(yōu)化固定化AMP具有指導意義，并為AMPs抗耐藥性的發(fā)展提供新的思路。
緩釋制劑能在長時間內(nèi)持續(xù)放藥達到長效作用，控釋制劑能在預定的時間內(nèi)使藥物按照預定的速度釋放，血藥濃度可長時間維持在有效濃度范圍之內(nèi)。目前，AMPs類藥物存在用藥穩(wěn)定性的問題，因而無法掌握藥物劑量的使用。將AMPs藥物與緩控釋技術(shù)相結(jié)合，可使抗菌藥物持續(xù)釋放，以此調(diào)節(jié)宿主的免疫反應，并大大降低手術(shù)和受傷后獲得性感染的發(fā)生率。同時，這種方法可能潛在地減少對抗生素耐藥性的發(fā)展。近年來，使用納米包封技術(shù)治療性抗感染創(chuàng)面敷料的研究體系逐漸形成，研究人員基于誘導AMPs基因表達和納米纖維包封技術(shù)的研究，提高了宿主免疫反應，可從許多方面攻擊病原體而不是像傳統(tǒng)抗生素那樣的單一，從而限制了抗性細菌的選擇。但是迄今為止，很少有研究考察由納米材料形成的免疫調(diào)節(jié)化合物的包封性在誘導AMPs生產(chǎn)中的作用。展望未來，需要多學科團隊利用體外和體內(nèi)模型進行臨床前研究，研究多種免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合應用于抗菌藥物生產(chǎn)，重要的是還需要進一步的研究來優(yōu)化化合物的包封和釋放。
隨著計算機和大數(shù)據(jù)科學的發(fā)展，以機器學習為代表的人工智能技術(shù)在分子設(shè)計和分子改造中的應用越來越廣泛，并日益突出其相對于傳統(tǒng)分子設(shè)計方法的準確高效的優(yōu)勢。機器學習的核心在于系統(tǒng)計算法，用計算的方法來模擬人類的學習行為——從歷史經(jīng)驗中獲取規(guī)律（或模型），并將其應用到新的類似場景中，其優(yōu)點可以概括為大數(shù)據(jù)、大模型、大計算。在大數(shù)據(jù)方面，運用基因組、宏基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組學和抗菌譜研究數(shù)據(jù)，開展AMPs基因、蛋白質(zhì)分子與抗菌譜關(guān)聯(lián)分析，從海量數(shù)據(jù)中獲取候選分子關(guān)鍵信息；在大模型方面，基于細菌、病毒和腫瘤細胞生物膜的結(jié)構(gòu)特征，建立膜-AMPs，AMPs-受體蛋白互作模型，開展分子動力學研究；在大計算方面，可以綜合考慮多物種的AMPs、受體分子和生理環(huán)境（pH值、滲透壓、離子強度等）因素，模擬在體作用機制。可以預見，隨著大規(guī)模分子篩選、人工智能及合成生物學等新技術(shù)的不斷進步，AMPs應用于臨床，在更大范圍和更深廣度上代替抗生素的時間不會遙遠，人類也會得到更安全更環(huán)保的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品。
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來源：[1]胡媛媛,姚 波*.魚類抗菌肽的研究進展[J].武漢工程大學學報,2020,42(01):8-17.[doi:10.19843/j.cnki.CN42-1779/TQ.201908002]
