摘要：創(chuàng)傷性腦損傷 (TBI) 后，因慢性炎癥引起的繼發(fā)性腦損傷是情緒和記憶障礙延遲發(fā)作的最主要原因。目前尚無(wú)治療方法可以有效減輕 TBI 后的繼發(fā)性腦損傷。原因之一是血腦屏障 (BBB)，它阻止大多數(shù)治療藥物進(jìn)入大腦。肽類藥物因其低免疫原性和毒性、生物利用度高且易于修改而成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療的主要候選藥物之一。在本研究中，我們證明，在彌漫性中度 TBI 小鼠模型中，非侵入性鼻內(nèi) (IN) 給藥 KAFAK（一種細(xì)胞穿透性抗炎肽）可以穿過(guò) BBB。值得注意的是，KAFAK 治療減少了導(dǎo)致繼發(fā)性損傷的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。此外，行為測(cè)試表明，接受 KAFAK 治療的小鼠在 TBI 后神經(jīng)系統(tǒng)、記憶力和運(yùn)動(dòng)能力得到改善或恢復(fù)。這項(xiàng)研究證明了KAFAK能夠穿過(guò)血腦屏障、降低體內(nèi)促炎細(xì)胞因子，并在中度TBI后恢復(fù)功能。
過(guò)去幾十年來(lái)，創(chuàng)傷性腦損傷 (TBI) 和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾�。ㄈ绨柎暮Ｄ�、腦腫瘤和帕金森�。┑陌l(fā)病率一直在上升 [ 1 ]。盡管發(fā)病率不斷上升，但目前可用的中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療方法相對(duì)較少 [ 2 ]。其中一個(gè)原因是，許多治療分子向大腦的輸送受到血腦屏障 (BBB) 的阻礙。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其之間的緊密連接限制了蛋白質(zhì)和核酸等大分子的運(yùn)輸 [ 3 ]。此外，由于血腦屏障的復(fù)雜性，大多數(shù)新開發(fā)的有效候選藥物在臨床試驗(yàn)中失敗 [ 4]因此，迫切需要探索治療腦部疾病的其他方法，例如使用可以穿透血腦屏障的肽。然而，當(dāng)采用口服給藥時(shí)，肽可能會(huì)被消化道中的酶快速降解；當(dāng)采用全身給藥時(shí)，肽可能會(huì)在血漿中快速降解 [ 4 , 5 ]。
非侵入性鼻腔內(nèi) (IN) 給藥是一種越來(lái)越常用的替代方法，用于克服 BBB 的局限性，從而增加腦部的治療負(fù)荷劑量。這最大限度地減少了藥物劑量，從而可以減少相關(guān)的副作用 [ 6 ]。此外，它還可以避免血清蛋白酶和消化酶，這些酶會(huì)顯著降低生物利用度 [ 4、5、7 ]。鼻腔內(nèi)給藥利用三叉神經(jīng)和嗅覺(jué)通路以及微血管，從而能夠?qū)⑺幬镙斔偷侥X實(shí)質(zhì) [ 4 ]。
由于具有毒性低、特異性高、生物利用度高和生產(chǎn)可擴(kuò)展等優(yōu)點(diǎn)，肽類藥物在治療領(lǐng)域已顯示出巨大的潛力 [ 8 ]。目前，約有 70 種治療性肽可供使用，還有更多肽類藥物正在臨床試驗(yàn)中。其中一些肽類藥物已證明其在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有潛力 [ 9,10 ]。然而，大多數(shù)肽類藥物尚未評(píng)估其穿過(guò)血腦屏障的能力。
除了直接治療疾病的肽外，一些肽還用于遞送藥物。其中包括細(xì)胞穿透肽 (CPP) 和受體介導(dǎo)肽 (RMP)。這些肽在促進(jìn)大分子穿過(guò)血腦屏障方面表現(xiàn)出特別有希望的結(jié)果 [ 11 , 12 ]。CPP 是內(nèi)源性或合成的小陽(yáng)離子或兩親性肽 [ 13]。內(nèi)源性肽載體效率高，細(xì)胞毒性小。某些內(nèi)源性肽能夠穿過(guò)血腦屏障，這激發(fā)了研究人員基于這些天然肽開發(fā)神經(jīng)藥物。CPP 轉(zhuǎn)運(yùn)的確切機(jī)制仍有爭(zhēng)議，但人們大多認(rèn)為它們是通過(guò)吸附介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行的，轉(zhuǎn)運(yùn)取決于細(xì)胞類型和貨物 [ 14 ]。與單獨(dú)的治療性肽相比，TAT 蛋白、SynB、穿透素和朊病毒肽等 CPP 已顯示出更好的治療性貨物轉(zhuǎn)運(yùn)到大腦的能力 [ 15]。相反，L57 RMP 通過(guò)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 1 (LRP1) 受體轉(zhuǎn)胞吞 BBB。我們最近在體外 BBB 模型中證明了其與另一種 RMP Angiopep-7 相比具有更好的通透性 [ 11 ]。
創(chuàng)傷性腦損傷 (TBI) 是一種復(fù)雜的疾病，具有細(xì)胞介導(dǎo)的繼發(fā)性損傷 [ 16 ]，即使是輕度損傷，也可能在數(shù)月后導(dǎo)致慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病 [ 17 ]。缺乏有效的診斷工具來(lái)檢測(cè)輕度至中度 TBI，缺乏有效的預(yù)防性治療來(lái)盡量減少繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致 TBI 管理困難。繼發(fā)性損傷可由多種因素引起，包括炎癥分子、活性氧和興奮性毒性。促炎細(xì)胞因子，如 TNF、IL-1β 和 IL-6，會(huì)促進(jìn)繼發(fā)性損傷的進(jìn)展 [ 18 , 19絲裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶 II (MK2) 通路在神經(jīng)元炎癥中起重要作用。MK2 通路活化增加與 TNF、IL-1β 和 IL-6 水平升高有關(guān)，而這會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性損傷。KAFAK 是一種抑制 MK2 的抗炎 CPP [ 7 ]。值得注意的是，局部植入含有這種具有治療活性的 CPP 和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的水凝膠可顯著減輕大鼠脊髓損傷模型中的炎癥[ 20 ]。此外，KAFAK 治療降低了骨關(guān)節(jié)炎離體模型中促炎細(xì)胞因子 TNF、IL-1β 和 IL-6 的表達(dá)[ 21 ]。
本研究使用了三種熒光標(biāo)記的治療性肽 FITC-KAFAK、FITC-L57-AIP-1 和 FITC-AIP-1，以比較它們?cè)谠笫竽X微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (BMVEC) 中的細(xì)胞攝取情況。AIP-1 是 KAFAK 的治療域。還評(píng)估了這三種肽的潛在細(xì)胞毒性。原代 BMVEC 代表 BBB 的初始結(jié)構(gòu)成分，在調(diào)節(jié)分子向腦部的運(yùn)輸方面發(fā)揮著重要作用 [ 22]。使用原代 BMVEC 可確保實(shí)驗(yàn)與體內(nèi) BBB 的情況非常相似。即使在低濃度下，KAFAK 也表現(xiàn)出比單獨(dú)的 L57-AIP-1 和 AIP-1 更好的吸收。此外，在小鼠中使用臨床相關(guān)的 IN 輸注進(jìn)行 KAFAK 療法，對(duì)小鼠 TBI 中線流體沖擊模型中的行為產(chǎn)生了保護(hù)作用。它還降低了大腦中的炎癥細(xì)胞因子水平。由于其能夠通過(guò) IN 輸注穿過(guò) BBB 并減少炎癥，KAFAK 有望成為一種藥物輸送劑和一種治療 MK2 通路上調(diào)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。
2 材料和方法
熒光標(biāo)記肽 KAFAK-RITC (羅丹明-B-KAFAKLAARLYRAKLARQLGVAA)、KAFAK-FITC (FITC-Ahx-KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA) 和 L57-AIP-FITC (FITC-AhxTWPKHFDKHTFYSILKLGKH-(Beta-ala)-LARQLGVAA-CONH2) 是定制的，從加拿大安大略省基奇納的 Biomatik 購(gòu)買。肽 AIP-FITC (FITC-Ahx-KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA) 是定制的，從美國(guó)肯塔基州路易斯維爾的 Aapptec 購(gòu)買。F12 培養(yǎng)基混合物的成分（10% 馬血清、10% 胎牛血清、谷氨酰胺、NaHCO 3、和肝素）購(gòu)自 ATCC USA，嘌呤霉素購(gòu)自 Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA。瓊脂糖和 Tris HCl 購(gòu)自 Avantor/VWR。IL-1β（EK0394）和 IL-6（EK0411）的 ELISA 試劑盒購(gòu)自 Boster Bio。TNF（BMS607-3）和 Pierce Rapid Gold BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)自 Thermo Fisher Scientific。使用的其他試劑包括 0.9% 鹽水（Teknova，加利福尼亞州半月灣，美國(guó)）、鹽酸氯胺酮（Vedco，密蘇里州圣約瑟夫，美國(guó)）、賽拉嗪（Vet One，菲律賓圣費(fèi)爾南多）、甲醛（Ward's Science，紐約州羅切斯特，美國(guó)）、聚甲基丙烯酸甲酯（Lang Dental，伊利諾伊州惠靈，美國(guó)）、低熔點(diǎn)瓊脂糖（IBI Scientific，愛荷華州杜比克，美國(guó)）、磷酸二氫鈉和沒(méi)食子酸正丙酯（MP Biomedicals，俄亥俄州索倫，美國(guó)）、磷酸氫二鈉和蔗糖（Sigma Aldrich，密蘇里州圣路易斯，美國(guó)），
成年 Sprague Dawley 大鼠購(gòu)自杰克遜實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行繁殖。根據(jù)路易斯安那理工大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的 2022-05 方案，通過(guò)頸椎離斷術(shù)處死 1-3 天大的幼崽。該方案包括根據(jù)或超過(guò)美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南》的要求盡量減少疼痛和不適的方法。從幼崽中提取皮質(zhì)細(xì)胞并在 F12 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有通過(guò)在培養(yǎng)基中摻入特定生長(zhǎng)因子分化為內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和/或小膠質(zhì)細(xì)胞的能力 [ 11 , 23 , 24]。首先分離神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，然后用5.51 µM嘌呤霉素純化。為了將它們分化為BMVEC，將純化的細(xì)胞培養(yǎng)在含有內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中。為了確保保留BMVECS的特征，研究中僅使用早期細(xì)胞傳代。
這些細(xì)胞被接種到涂有聚賴氨酸的96孔黑壁板中，密度為每孔10,000個(gè)細(xì)胞。然后在37°C、5% CO 2的條件下培養(yǎng)直到 50–80% 匯合。隨后，用不同濃度的熒光標(biāo)記肽 FITC-KAFAK、FITC-L57-AIP-1 和 FITC-AIP-1 處理它們，所有這些肽均可溶于 PBS。在 500 µL PBS 中制備肽原液（2 mg/mL），并通過(guò)用培養(yǎng)基新鮮稀釋原液來(lái)制備肽的工作濃度（10 µL、20 µL、30 µL、50 µL、75 µL）。使用兩個(gè)不同的細(xì)胞傳代對(duì)每種肽進(jìn)行三次測(cè)試，而未處理的細(xì)胞則用作對(duì)照。達(dá)到所需的匯合度后，用含有適當(dāng)肽濃度的培養(yǎng)基替換孔中的培養(yǎng)基，并在 37 °C 下在 5% CO 2 中孵育 4小時(shí)。孵育后，用溫?zé)岬?PBS 輕輕洗滌細(xì)胞三次，去除多余的肽以減少背景熒光。然后用多聚甲醛固定細(xì)胞 10 分鐘，再用 PBS 洗滌，用 DAPI 染色以顯示細(xì)胞核。從每個(gè)孔的三個(gè)不同隨機(jī)選擇區(qū)域獲取落射熒光圖像，同時(shí)使用一致的圖像采集設(shè)置在 10 倍和 20 倍放大率下使用相差來(lái)顯示細(xì)胞，并使用 FITC（激發(fā)：470 nm，發(fā)射：530 nm）和 DAPI（激發(fā)：358 nm，發(fā)射：461 nm）濾光片分別顯示熒光標(biāo)記的肽和細(xì)胞核。使用配備有數(shù)碼彩色相機(jī)的 Leica DMI 6000B（Leica Microsystems, Inc.，美國(guó)伊利諾伊州迪爾菲爾德）倒置顯微鏡捕捉圖像。
使用 ImageJ 軟件 ( https://imagej.net/ij/于 2022 年 1 月 15 日訪問(wèn))量化熒光強(qiáng)度。從每個(gè)孔中隨機(jī)選擇 20 個(gè)細(xì)胞來(lái)測(cè)量以相對(duì)熒光單位 (rfu) 表示的平均熒光強(qiáng)度。然后，減去每個(gè)孔的背景熒光強(qiáng)度平均值，再用對(duì)照孔的平均熒光強(qiáng)度對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。未溶解的肽聚集體和圓形細(xì)胞不包括在分析中。
還使用三種肽 FITC-KAFAK、FITC-L57-AIP-1、FITC-AIP-1 的不同濃度（每種 10 µM、30 µM、50 µM、100 µM、250 µM 和 500 µM）在 BMVEC 中評(píng)估細(xì)胞毒性，重復(fù)三次。首先，將細(xì)胞接種到 96 孔板中，密度為每孔 10,000 個(gè)細(xì)胞，并用三種肽濃度中的一種處理細(xì)胞，而對(duì)照孔則接受不含肽的相同培養(yǎng)基。處理后，將細(xì)胞在 37 °C 和 5% CO 2下孵育按照 CellTiter-Glo 1.0 ATP 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)威斯康星州麥迪遜市 Promega 公司）的說(shuō)明，將板在室溫下孵育 30 分鐘，使其平衡。接下來(lái)，將 CellTiter-Glo 底物、緩沖液混合物和 100 µL 試劑添加到每個(gè)孔中的 100 µL 培養(yǎng)基中。然后將板放在軌道振蕩器上 2 到 3 分鐘，使細(xì)胞裂解。使用 Biotek Cytation（美國(guó)加利福尼亞州圣克拉拉市安捷倫科技公司）記錄發(fā)光。
所有實(shí)驗(yàn)程序、動(dòng)物護(hù)理和處理均按照路易斯安那理工大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的 2202-3 號(hào)方案進(jìn)行。野生型 C57BL/6NHsd 小鼠從杰克遜實(shí)驗(yàn)室采購(gòu)，隨后根據(jù)需要進(jìn)行繁殖。在濕度和溫度受控的動(dòng)物飼養(yǎng)箱中，為小鼠提供無(wú)限量的食物和水，同時(shí)保持 12 小時(shí)的黑暗/光照循環(huán)。該方案還描述了根據(jù)或超過(guò)美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南》的要求來(lái)盡量減少疼痛和不適的方法。
12 只小鼠用于初步實(shí)驗(yàn)，通過(guò)腹膜內(nèi) (IP) 和 IN 給藥確定 KAFAK 的 BBB 通透性。它們沒(méi)有受到傷害。該過(guò)程的詳細(xì)信息請(qǐng)參閱題為“BBB 通透性的評(píng)估”的部分。
總共 24 只 8-16 周齡小鼠，隨機(jī)分配到以下治療組，每組 4 只雄性小鼠和 4 只雌性小鼠：(1) 假性 TBI 加載體治療 (Sham)，(2) 中度 TBI 加載體治療 (TBI)，以及 (3) TBI 后給予 KAFAK 治療 (KAFAK)。治療在受傷后一小時(shí)內(nèi)通過(guò)鼻腔給藥 (24 µL 500 µM KAFAK 溶液)。
為了使用 ELISA 研究 KAFAK 的抗炎作用，將 20 只小鼠隨機(jī)分配到以下四組中：假手術(shù)組（IN 載體治療）、TBI（IN 載體治療）、TBI 和 IN 輸送 KAFAK（24 µL 500 µM KAFAK）以及 TBI 和 IP 注射 KAFAK（14.6 mg/kg）。在實(shí)驗(yàn)早期進(jìn)行了功效分析以確定組大小。
根據(jù)我們之前發(fā)表的研究，在麻醉下進(jìn)行了中線液壓沖擊傷 (mFPI) [ 16]。簡(jiǎn)而言之，在前囟門和人字門之間的中線處開顱，并將魯爾鎖連接器連接到頭骨上。連接器中充滿了無(wú)菌鹽水，并用Parafilm密封。所有程序均在麻醉下進(jìn)行。當(dāng)天晚些時(shí)候，使用流體沖擊裝置注入短暫的水脈沖，壓低硬腦膜，導(dǎo)致中度彌漫性腦損傷。將小鼠置于仰臥位并記錄其翻正時(shí)間。這是用于確認(rèn)中度TBI的指標(biāo)之一。之后，密封開顱口并將小鼠放回其籠子中，并在將其放回動(dòng)物飼養(yǎng)箱之前監(jiān)測(cè)其在籠子內(nèi)的正常運(yùn)動(dòng)。
稱量小鼠并將其分入單獨(dú)的籠子，讓其適應(yīng)這種狀況，然后再用于研究。使用 SomnoSuite 數(shù)字汽化器系統(tǒng)（美國(guó)康涅狄格州托靈頓市肯特科學(xué)公司）以 500 mL/min 的速度對(duì)小鼠進(jìn)行鎮(zhèn)靜。在用 1% 異氟烷治療期間，小鼠保持輕度鎮(zhèn)靜，仰臥 70 度。通過(guò)鼻腔輸注給予 6 µL 治療劑（KAFAK 或載體），然后以一分鐘為間隔交替進(jìn)行三次治療。輸注五分鐘后，停止給予異氟烷，將小鼠移回原來(lái)的籠子并監(jiān)測(cè)五分鐘，然后再將其放回動(dòng)物飼養(yǎng)箱。
腹腔注射小鼠的處理方式與腹腔注射類似。將 KAFAK (14.6 mg/kg) 或載體注射到腹腔內(nèi)，同時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行鎮(zhèn)靜并使其保持仰臥姿勢(shì)，如腹腔注射所述。將每只小鼠放入籠子中，并至少監(jiān)測(cè)五分鐘，然后再將其放回飼養(yǎng)箱。
小鼠通過(guò)鼻腔或腹膜內(nèi)接受單次 FITC-KAFAK 或 RITC-KAFAK 治療，以評(píng)估 KAFAK 的 BBB 通透性。FITC 和 RITC 標(biāo)記的 KAFAK 用于確定在腦中可視化 KAFAK 的最有效標(biāo)記。治療四小時(shí)后，每只小鼠用 2% 異氟烷鎮(zhèn)靜，流速為 500 mL/min。然后分別以 100 mg/kg 和 10 mg/kg 的劑量腹腔注射氯胺酮/賽拉嗪混合物。之后，為了減輕壓力，將小鼠放回籠子里。深度麻醉后，將每只小鼠以仰臥姿勢(shì)固定在穿孔尸檢臺(tái)上。切開胸腔，并在右主動(dòng)脈上開一個(gè)縫隙以方便血液引流。然后通過(guò)左心室泵入 25 mL 1×冰冷 PBS 來(lái)置換血液。
使用 EMS-500 振蕩組織切片機(jī)（美國(guó)賓夕法尼亞州哈特菲爾德電子顯微鏡科學(xué)公司）將冷凍腦切成 60 µm 厚的冠狀切片，然后在 4 °C 的黑暗環(huán)境中保存直至制備載玻片。腦切片用 DAPI 復(fù)染以顯示細(xì)胞核。用梯度濃度的酒精制備組織切片，然后使用防褪色封固劑將其封固在載玻片上。腦切片（包括嗅球）按從前端到后端的順序排列在載玻片上。將載玻片密封并保存在黑暗環(huán)境中，然后用 Olympus IX51 落射熒光顯微鏡進(jìn)行成像。為防止熒光染料光漂白，通過(guò)最小化光強(qiáng)度、采集時(shí)間并首先執(zhí)行 FITC 或 RITC 圖像捕獲來(lái)優(yōu)化圖像采集。
使用型號(hào)為 76-0770 的轉(zhuǎn)棒系統(tǒng)（Panlab，巴塞羅那，西班牙）進(jìn)行轉(zhuǎn)棒測(cè)試以評(píng)估前庭運(yùn)動(dòng)功能。為了盡量減少壓力，讓小鼠適應(yīng)環(huán)境至少 10 分鐘，每次測(cè)試后清潔轉(zhuǎn)棒室。記錄平均跌倒時(shí)間（延遲時(shí)間）以評(píng)估每只小鼠的表現(xiàn)。每個(gè)測(cè)試日包含三次獨(dú)立試驗(yàn)，第二次試驗(yàn)后休息 10 分鐘。測(cè)試在每天的同一時(shí)間段進(jìn)行。記錄每天兩次最佳分?jǐn)?shù)的平均值。小鼠在 TBI 前 -3、-2、-1 天接受訓(xùn)練。每只小鼠從 -1 天開始的平均分?jǐn)?shù)被用作其基線分?jǐn)?shù)，以標(biāo)準(zhǔn)化受傷后第二天、第五天和第七天（分別為第 2 天、第 5 天和第 7 天）的測(cè)試延遲時(shí)間。這些測(cè)試在一天中的同一時(shí)間進(jìn)行。第 2、5 和 7 天的分?jǐn)?shù)根據(jù)每只動(dòng)物的基線（-1 天）分?jǐn)?shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以盡量減少差異 [16 ]。
這一系列測(cè)試旨在評(píng)估反射、平衡、視覺(jué)和觸覺(jué)障礙。為了評(píng)估這些障礙，進(jìn)行了八項(xiàng)測(cè)試：驚嚇?lè)磻?yīng)（突然拍手）、尋求行為、后肢屈曲、在 30 厘米長(zhǎng)、1 厘米、2 厘米和 3 厘米寬的高架桿上行走、在 0.5 厘米寬的方梁上保持平衡至少 30 秒，以及在直徑為 0.5 厘米的桿上保持平衡。未能完成任務(wù)會(huì)在 mNSS 結(jié)果中加一分。零分表示功能未受損，分?jǐn)?shù)越高，腦損傷和神經(jīng)功能障礙的嚴(yán)重程度就越高 [ 16 ]。
進(jìn)行行為測(cè)試以比較 KAFAK 對(duì)治療組之間記憶功能的影響。NOR 測(cè)試基于嚙齒動(dòng)物探索不熟悉物體的自然傾向。該測(cè)試在低壓力條件下進(jìn)行，在適應(yīng)開放盒子 5 分鐘后進(jìn)行。此外，每只老鼠測(cè)試后都會(huì)清潔盒子。開始測(cè)試時(shí)，將一只老鼠放在一個(gè)方形開放式盒子（30 × 30 厘米，墻壁高 25 厘米）的中心，盒子的對(duì)角放置大小相似的物體。在老鼠探索物體的同時(shí)，記錄老鼠 5 分鐘的行為。將其中一個(gè)物體移除并替換為另一個(gè)具有不同形狀的物體（新物體），并記錄老鼠的行為另外 5 分鐘。MATSAP 軟件（https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/58412-matsap，訪問(wèn)于 2022 年 4 月 20 日）用于量化與物體相處的時(shí)間。辨別指數(shù) (DI) 計(jì)算為 (與新物體相處的時(shí)間 × 100)/(與剩余原始物體相處的時(shí)間 + 與新物體相處的時(shí)間) [ 25 ]。
NOR 測(cè)試的視頻以每秒 10 幀的速率轉(zhuǎn)換為音頻視頻交錯(cuò) (AVI) 文件。然后對(duì)文件進(jìn)行解壓縮，刪除音頻，然后轉(zhuǎn)換為灰度。之后，將視頻縮短至 5 分鐘 (300 秒)，并從最后一幀中移除鼠標(biāo)，以使用該幀作為背景 [ 25 ]。如果需要，可以將幀稍微裁剪為精確的正方形。然后將視頻文件轉(zhuǎn)換為多 TIFF 文件，使用 MATLAB 軟件 (版本 R2012a) 中的插件進(jìn)行分析。
為了評(píng)估 KAFAK 減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力，小鼠在 mFPI 后的第一個(gè)小時(shí)內(nèi)通過(guò) IN 遞送或 IP 注射（16.4 mg/kg）接受 KAFAK（24 µL 500 µM KAFAK）。小鼠在治療后 12 小時(shí)被麻醉并灌注，但不固定，如題為“BBB 通透性評(píng)估”的部分所述。使用含有裂解緩沖液（每個(gè)半球 500 µL）的手持式組織勻漿器提取、稱重和勻漿大腦。所有腦組織的處理和加工均在寒冷條件下進(jìn)行，以避免細(xì)胞因子降解。勻漿后，對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理并放置在 4 °C 的軌道振蕩器上 15 分鐘，然后以 19,000× g離心. 樣品上清液儲(chǔ)存在 −80 °C 下直至進(jìn)行 ELISA 檢測(cè)。對(duì)于 ELISA，樣品在冰上解凍，并通過(guò) BCA 檢測(cè)定量蛋白質(zhì)濃度。用裂解緩沖液稀釋樣品以確保測(cè)量值在試劑盒的工作范圍內(nèi)，然后根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行 ELISA。
使用 SPPS 軟件版本 28.0.1.0 對(duì)行為測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用 Gpower 版本 3.1.9.7 計(jì)算統(tǒng)計(jì)功效以確定實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)量。分析由對(duì)治療條件不知情的人員進(jìn)行。在統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)期間，使用 Bonferroni 校正對(duì)所有多重比較進(jìn)行調(diào)整。
3.結(jié)果
4 討論
據(jù)報(bào)道，KAFAK 在骨關(guān)節(jié)炎模型中具有抗炎作用 [ 7，21 ]。值得注意的是，與其他 CPP 相比，該肽表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞穿透能力和更低的毒性。此外，將含 KAFAK 的水凝膠侵入性直接注射到大鼠脊髓損傷部位也能夠減輕炎癥 [ 20 ]。然而，其滲透血腦屏障的能力以及使用非侵入性、臨床相關(guān)的給藥途徑治療 TBI 和其他神經(jīng)炎癥疾病的適用性尚未得到研究。KAFAK 能夠穿過(guò)血腦屏障、減少炎癥并改善腦損傷后的行為結(jié)果是本研究的動(dòng)機(jī)。
在我們之前的研究中，與另一種受體介導(dǎo)的肽血管肽素-7 (Angiopep-7) 相比，使用原代 BMVEC 的體外 BBB 模型中，RMP L57 表現(xiàn)出更高的細(xì)胞攝取量 [ 11 ]。L57 肽通過(guò) LRP-1 受體內(nèi)化，該受體在多種疾病條件下高度表達(dá) [ 26 , 27]。在本研究中，我們?cè)谂c之前研究相同的 BMVEC 模型中比較了 KAFAK 的攝取、L57 與抗炎肽 AIP-1 (L57-AIP-1) 結(jié)合的攝取以及單獨(dú)的 AIP-1 肽的攝取。我們的結(jié)果顯示，與 L57-AIP-1 結(jié)合物相比，KAFAK 的攝取提高了 3 至 5 倍，與單獨(dú)的 AIP-1 肽相比，攝取提高了 14 至 25 倍。我們的陰性對(duì)照 AIP-1 的細(xì)胞攝取水平較低是意料之中的，因?yàn)檫@種肽既不是 CPP 也不是 RMP。這些結(jié)果與我們之前的研究一致，其中使用肝細(xì)胞炎癥的 LPS 模型，與 AIP-1 相比，KAFAK 在較低濃度下具有治療效果 [ 28]。此外，與低至中等濃度的相同濃度的 KAFAK 相比，L57-AIP-1 和 AIP-1 肽在 BMVEC 中引起的毒性水平相同。在非常高的濃度下觀察到的 KAFAK 毒性可能是由于 KAFAK 的細(xì)胞攝取量高得多。KAFAK 的細(xì)胞攝取量較高表明相對(duì)較低的劑量可以有效減少炎癥。此外，根據(jù)先前的報(bào)告，IN 遞送所需的量?jī)H為全身遞送所用量的一小部分，因此可以進(jìn)一步降低劑量水平[ 29，30 ]。
在腦損傷（如 TBI 或缺血性中風(fēng)）后，迅速減少炎癥至關(guān)重要，以盡量減少導(dǎo)致慢性神經(jīng)炎癥和潛在長(zhǎng)期神經(jīng)系統(tǒng)損傷的急性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng) [ 31，32，33，34 ]。由于 KAFAK 在骨關(guān)節(jié)炎模型 [ 21 ] 和脊髓損傷模型 [ 20 ]中的抗炎作用，我們推斷 KAFAK 會(huì)減少引發(fā)繼發(fā)性損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)的炎癥，從而減少或預(yù)防慢性炎癥。然而，KAFAK 的先前應(yīng)用依賴于工程納米顆粒 (NP) 中肽的相對(duì)緩慢釋放，以實(shí)現(xiàn)全身遞送 [ 21] 以及直接涂抹在脊髓傷口上的水凝膠 [ 20 ]。為了最大限度地增加可用于緊急治療的劑量，我們選擇使用未受保護(hù)的 (游離) KAFAK。然而，靜脈注射時(shí)游離肽容易被血清蛋白酶降解 [ 21 , 35 ]，口服時(shí)容易被消化酶降解 [ 4 , 36 ]。為了彌補(bǔ)生物利用度的損失，劑量可以增加很多倍。然而，高劑量可能會(huì)導(dǎo)致不良的副作用 [ 30 ]。
與全身給藥的高劑量相比，IN 給藥通常使用明顯較低的劑量。IN 方法還具有快速吸收和分布到大腦 [ 30 ]、化合物代謝減少導(dǎo)致生物利用度更高 [ 37 ] 以及從神經(jīng)上皮到體循環(huán)的流出量低 [ 38]等優(yōu)點(diǎn)。]。這些優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，可以最大限度地提高相對(duì)低劑量游離肽（如 KAFAK）的生物利用度，從而快速輸送到大腦，同時(shí)將全身副作用降到最低。然而，鼻腔輸送的缺點(diǎn)可能會(huì)削弱游離 KAFAK 的益處。這些缺點(diǎn)包括由于鼻腔內(nèi)運(yùn)輸面積相對(duì)較小而導(dǎo)致的劑量/體積限制、pH 范圍的限制以及粘膜肽酶是否會(huì)降解 KAFAK 的不確定性 [ 4]。這些缺點(diǎn)對(duì)于 KAFAK 輸注來(lái)說(shuō)可能微不足道，因?yàn)楸狙芯康慕Y(jié)果導(dǎo)致小鼠行為指標(biāo)顯著改善，促炎細(xì)胞因子濃度降低。此外，我們的研究結(jié)果表明，通過(guò)熒光成像觀察到，以最小劑量無(wú)創(chuàng)性地注射熒光標(biāo)記的 KAFAK 會(huì)導(dǎo)致肽在腦實(shí)質(zhì)中彌散分布。相反，腹腔注射導(dǎo)致熒光強(qiáng)度較低，這意味著這種給藥途徑不如 KAFAK 的腹腔注射有效。
在本研究中，在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型中明顯觀察到了 KAFAK 的細(xì)胞攝取，并且在體內(nèi)模型中觀察到了穿過(guò)血腦屏障。然而，沒(méi)有采用更定量的方法來(lái)研究其穿過(guò) BBB 的通透性。未來(lái)的工作將包括體外測(cè)定，以確定 KAFAK 穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞屏障的速率，使用帶有 BMVEC 的 transwell 模型。雖然本研究提供了 KAFAK 經(jīng)鼻給藥產(chǎn)生顯著有益效果的證據(jù)，但給藥方案將在未來(lái)的研究中進(jìn)行優(yōu)化。這些未來(lái)的研究還將確定經(jīng)鼻給藥途徑的缺點(diǎn)是否會(huì)顯著降低肽在腦中的生物利用度。如果是這樣，納米顆粒將被設(shè)計(jì)成能夠讓肽高效地通過(guò)鼻腔，并在腦微血管中快速釋放。21、35、39 ] 。盡管我們觀察到行為上不存在顯著的性別差異，但仍有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究，包括確定藥代動(dòng)力學(xué)、毒性和對(duì)劑量水平的反應(yīng)的潛在差異。
細(xì)胞因子 TNF、IL-1β 和 IL-6 是與 TBI 后繼發(fā)性損傷有關(guān)的生物標(biāo)志物。在本研究中，我們?cè)u(píng)估了在彌漫性 TBI 誘發(fā)后不久施用 KAFAK 肽是否會(huì)降低這些促炎細(xì)胞因子的水平。與接受載體治療的假手術(shù)小鼠相比，IN 施用 KAFAK 導(dǎo)致 TNF 和 IL-1β 水平顯著降低。值得注意的是，MK2 通路與這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生密切相關(guān) [ 40 ]，而 KAFAK 通過(guò)抑制該過(guò)程發(fā)揮作用 [ 7 ]。這些促炎細(xì)胞因子的減少可能是由于大腦中的 MK2 通路受到抑制。
與經(jīng)腹腔注射給藥相比，腹腔注射 KAFAK 不會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子水平顯著降低（與受傷且接受載體治療的小鼠相比）。此外，腹腔注射給藥組的 IL-1β 水平顯著高于經(jīng)腹腔注射給藥組。這些結(jié)果表明，經(jīng)腹腔注射給藥比腹腔注射給藥更有效。腹腔注射給藥的化合物可通過(guò)門脈系統(tǒng)進(jìn)入全身循環(huán)，而酶促降解會(huì)降低其生物利用度 [ 41 ]。因此，腹腔注射給藥效果的降低可能是由于全身稀釋和酶促降解的共同作用。
