摘要 對環(huán)肽進行了分類, 并對具代表性的經(jīng)典型、DKP (Diketopiperazine, 哌嗪二酮)型、醚橋型、烯橋型、單硫及多硫醚型、剛性橋型、仲(叔)胺型、Mannich 堿型、聯(lián)苯型及 Freidinger 型環(huán)肽的合成方法逐一進行了描述.
近幾十年來從自然界、機體內(nèi)或化學合成得到的大量肽化合物, 以高生物活性、低毒副作用的特點引起了藥物化學家的高度關注. 許多情況下, 直鏈肽的分子柔曲性(flexibility)造成的構象易變使其與受體結合的強度及選擇性受到影響. 此外, 機體內(nèi)的氨肽酶及羧肽酶也很方便地從直鏈肽兩個端基逐步切割肽鏈, 使之降解. 因此肽鏈的環(huán)化改造, 使其構象限定(constrained conformation)是改善肽分子生物穩(wěn)定性、提高生物活性的理想途徑之一. 不少研究已經(jīng)證明, 從直鏈的先導結構肽改為環(huán)肽后使原有的生物活性提高十幾倍至幾萬倍. 許多具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性的天然產(chǎn)物肽往往含有不同類型的主鏈環(huán)化結構. 本文擬從環(huán)肽的系統(tǒng)分類入手, 對一些鏈環(huán)(loop)中不同橋連結構的環(huán)肽特征及合成方法進行綜述.
1 環(huán)肽分類
如何對在自然界起著重要作用的環(huán)肽進行分類, 至今尚無一個權威的、嚴格的標準. 本文從以下幾個不同的角度進行歸類:
1.1 從酰胺鍵角度分類
從酰胺鍵角度可將環(huán)肽分為均環(huán)肽(Homodetic cyclopeptides)和雜環(huán)肽(Heterodetic cyclopeptides)兩類. 均環(huán)肽指主鏈環(huán)均由酰胺鍵連接, 因此橋連結構單一; 雜環(huán)肽指主鏈環(huán)中除了酰胺鍵外, 還有其它橋連結構, 因此又包括多種類型.
1.2 按來源分類
從來源角度可按圖 1 對環(huán)肽進行分類:
1.3 按橋頭位置分類
按橋頭位置可將環(huán)肽分為 7 類, 見圖 2.
1.4 按橋連結構分類
按橋連結構可將環(huán)肽分為經(jīng)典環(huán)肽和非經(jīng)典環(huán)肽經(jīng)典環(huán)肽又包括內(nèi)酰胺橋、內(nèi)酯橋和二硫橋; 非經(jīng)典環(huán)肽包括醚橋、烯橋、單硫或多硫橋、剛性支架橋、胺橋、聯(lián)苯橋、Mannich 堿橋、PNA (Peptide nucleic acid, 肽核酸)橋等.
1.5 按主鏈環(huán)數(shù)分類
按主鏈環(huán)數(shù)將環(huán)肽分為單 loop 型, 雙 loop 型和多l(xiāng)oop 型.
2 經(jīng)典環(huán)肽合成
已有的各種環(huán)肽化合物中, 以內(nèi)酰胺(又稱均環(huán)肽)、二硫鍵或內(nèi)酯鍵(depsi-)為橋連結構的環(huán)肽占絕大多數(shù), 而且它們的合成方法比較常見、經(jīng)典. 因此這三種環(huán)肽又被稱為經(jīng)典環(huán)肽.
2.1 內(nèi)酰胺為橋的環(huán)肽合成
此類環(huán)肽的合成例很多, 總體上可以存在兩個方式: (1)使用縮合劑的羧基活化型; (2)無縮合劑的分子內(nèi)氨解型. 前者對均相溶液法及固相法都適用, 后者多用于固相合成. 已有文獻記載的內(nèi)酰胺環(huán)肽合成非常多, 下面僅介紹一些有代表性的方法.
2.1.1 側鏈連接固相法
利用谷氨酸(或天冬氨酸)的側鏈COOH與固相載體形成酯鍵連接. 隨后先脫除 Fmoc, 使谷氨酸的 α-氨基游離, 以便向 N 端組裝肽鏈. 全部縮合完成后, 用鈀試劑脫除 C 端 Allyl, 使谷氨酸的羧基游離; 再脫除 N 端的Fmoc, 使肽鏈N端氨基游離. 最后在縮合劑HBTU作用下, N 端及 C 端縮合形成內(nèi)酰胺鍵形成環(huán)肽(Scheme 1)[20].
2.1.2 溶液假稀釋法
在傳統(tǒng)溶液法進行分子內(nèi)環(huán)合反應時, 為了避免分子間的縮合必需使反應物在溶液中盡量稀釋. 然而這種高度稀釋的條件會造成反應時間延長、副反應較多, 也給后處理帶來不方便. 針對這種情況, Amore 等[21]使用一種空間位阻大的樹突狀硅烷取代的碳二亞胺作為縮合 劑 , 代 替 常 規(guī) 試 劑 DCC (N,N-dicyclohexylcarbodiimide, 二環(huán)己基碳二亞胺)進行溶液方式的內(nèi)酰胺環(huán)肽合成, 得到純度很高的目標產(chǎn)物(Scheme 2).
2.1.3 固相分子內(nèi)氨解法
由于羧酸肟酯(RCOON＝R')鍵對親核試劑高度敏感, 可以使用以肟為 linker 的固相載體, 制備頭-尾鍵合的內(nèi)酰胺環(huán)肽. 最后一步環(huán)合不用縮合劑可以同時完成分子內(nèi)氨解及脫除固相載體(Scheme 3)[22].
2.1.4 固相保險連接型分子內(nèi)氨解法
保險連接(Safety-catch linker)的特點是在目標結構的合成中非常穩(wěn)定. 只有經(jīng)特定的結構轉化, 該 linker被活化后才發(fā)生裂解反應[23]. 下面的環(huán)肽合成以鄰芐氧苯酚為保險樹脂 linker 結構, 在肽鏈組裝完成后脫除linker 上的芐基, 使鄰位的酚酯鍵活化. 此時肽鏈 N 端氨基很容易進攻酚酯鍵, 發(fā)生分子內(nèi)氨解, 得到環(huán)肽產(chǎn)物(Scheme 4)[24].
2.1.5 分子內(nèi)硫酯交換/分子內(nèi)氨解法
主要合成步驟依次為: (1)使 Fmoc-Asp-OAllyl 的側鏈 COOH 與羥基樹脂鍵合為芐酯型 linker; (2)脫除Fmoc, 并向 N 端組裝肽鏈; (3)在 N 端引入 Trt-Cys(Xan)作為硫酯交換及氨解反應的前體結構; (4)脫除 C 端Asp-OAllyl 上的 Allyl 使 COOH 游離進而與 Phe-SBzl縮合, 形成硫酯交換反應的底物結構; (5)脫除 N 端 Cys上的兩個保護基, 使 α-NH2及 SH 游離; (6)在 pH 7.5 條件下進行分子內(nèi)硫酯交換及氨解反應, 形成內(nèi)酰胺環(huán)肽; (7) TFA 切除 Asp 側鏈上的固相載體, 使產(chǎn)物游離, 總收率高達 80% (Scheme 5)[25].
2.1.6 偽 Pro 協(xié)助寡肽環(huán)化法
不含 Pro 或 Gly 的短鏈肽因張力影響很難被環(huán)化. 為此可以在組裝肽鏈時把目標序列中的 Thr 殘基用丙酮保護, 暫時生成五元環(huán), 使其模擬 Pro 的轉折誘發(fā)結構(turn inducer), 達到減弱寡肽鏈張力、易于環(huán)化的目的. 待環(huán)肽形成后, 經(jīng)溫和酸處理脫除丙酮保護基團, 恢復Thr 的結構. 此方式使產(chǎn)物總收率由＜5%提高到 80%以上(Scheme 6)[26].
2.2 二硫橋環(huán)肽合成
此種環(huán)肽合成的方法學也很成熟. 主要合成方式為先組裝肽鏈, 然后脫除半胱氨酸及其它殘基上的側鏈保護基. 最后用適當?shù)难趸瘲l件, 如空氣, H2O2, I2, Hg2＋鹽, Fe3＋鹽, DMSO 等將游離的 SH 氧化為二硫鍵. 應該注意的是在溶液中進行分子內(nèi)氧化反應時必須控制游離肽的濃度不宜過高, 一般在 1 mmol/L之下. 否則會存在分子間搭橋的副反應. 這就是保證分子內(nèi)成鍵的高稀釋原則. 相比之下, 固相合成發(fā)揮的假稀釋效應(Pseudo-dilution effect)可以基本保證分子內(nèi)氧化環(huán)合[27]. 當目標結構中含有兩對以上二硫鍵時, 如何正確搭橋便成為關鍵. 下面將介紹幾種不同的合成策略, 解決正確形成二硫鍵(主鏈 Folding)的問題.
2.2.1 熱力學同步合環(huán)法
以固相肽合成方式合成轉移生長因子(TGF)-α(含50 個殘基、6 個半胱氨酸)為例. 其中 6 個半胱氨酸的側鏈巰基均用 MBzl(對甲基芐)保護. 最后一步用 HF 裂解, 在切除樹脂的同時也把包括 MBzl 在內(nèi)的全部側鏈保護脫除. 由于在 HF 裂解試劑中加入足量的還原型谷胱甘肽(GSH), 有效地阻止了 TGF-α 游離肽 6 個 Cys 殘基間的隨意鍵合. 然后使開鏈型的粗產(chǎn)品處在高濃度(8 mmol/mL)的脲素水溶液中, 迫使 TGF-α 分子鏈伸展開, 呈“變性”(de-nature)狀態(tài). 再將此溶液置于透析袋中, 隨著袋外溶液脲素濃度逐步降低, 使結合態(tài)的 GSH 被透析清除的同時, TGF-α 鏈也由原來的伸展式 de-nature狀態(tài)逐步自然卷曲. 其根據(jù)是內(nèi)源性的TGF-α具有的卷曲狀態(tài)(由三對二硫鍵形成)應該是自然形成的最低能量狀 態(tài) . 研究已證明 , TGF-α 的三對二硫鍵是以Cys8-Cys21, Cys16-Cys32, Cys34-Cys43 的形式存在的. 因此, 長時間、緩慢地進行正確的二硫鍵搭橋是一個熱力學控制過程. 如果氧化反應條件過強、時間過快, 可能出現(xiàn)錯誤搭橋的情況. 這種不正確的 Folding 會導致生物活性的喪失(Scheme 7)
2.2.2 正交保護/分步合環(huán)法
采用對脫除反應敏感性不同的保護基, 分別保護不同位點 Cys 上的側鏈巰基, 使多種 Cys 在不同化學環(huán)境中分階段進行選擇性配對搭橋, 是正交保護/分步合環(huán)的基本原理. 此種方式的實施應注意以下幾點: (1)因為要經(jīng)歷多次氧化成環(huán)反應, 為盡量減少分子間搭橋的機會, 應以固相環(huán)合方式為宜. (2)需要橋連的一對 Cys 必需用同種保護基. (3)各對 Cys 的側鏈保護基必需與其它Cys 的保護基不同, 而且它們的脫除反應敏感性差別愈大愈好, 以便互不干擾, 發(fā)揮正交效應. (4)全部(或除一對 Cys 以外)Cys 保護基的脫除反應不應造成固相載體上 linker 鍵的提前裂解. Scheme 8 給出了含三對二硫鍵的肽合成情況, 其中一對用弱酸敏感的 Trt(三苯甲基)保護; 第二對用強酸敏感的 MoB(對甲氧基芐)保護. 它們之間屬于酸梯度差敏感方式. 第三對用 Acm 保護, 它與前兩種保護基互為正交敏感方式.
2.2.3 多米諾硫酯交換法
Tam 教授[28]建立了一種方便、可行、巧妙地制備多重二硫橋環(huán)肽的合成方法. 此種目標環(huán)肽的前體必須在N 端具有一個 Cys 殘基, 在 C 端含有硫酯結構, 而且在肽鏈中間必需含有一個或以上的 Cys 殘基. 如中間體 1, 在 pH 為 7.6 的水溶液中, 首先發(fā)生鏈中最接近 C 端的SH進攻C端硫酯鍵的硫酯交換反應得到中間體2. 隨后發(fā)生從 C 至 N 方向的多次硫酯交換反應, 就像拉鏈(又稱多米諾)效應, 直到 N 端最后一個 SH 成為硫酯. 當然, 中間的Cys殘基又恢復到游離SH狀態(tài)成為中間體3. 此時肽鏈的 N 端與 C 端相連, 因此 N 端 Cys 的 NH2很容易對最后一個硫酯進行分子內(nèi)氨解反應, 生成內(nèi)酰胺環(huán)肽 4. 在 4 中, 由于環(huán)的張力影響, 鏈中相鄰的 SH 很難形成二硫鍵. 而位置相對較遠離的兩個 SH 之間則可以形成熱力學上有利的二硫橋(如 5)的結構. 最后一對帶有 Acm 保護的兩個巰基在脫除 Acm 后, 也成為二硫橋, 得到多 loop 型環(huán)肽產(chǎn)物 6 (Scheme 9).
2.3 酯環(huán)肽(Cyclo-depsipeptides)合成
2.3.1 Kahalalide B 的合成
在天然產(chǎn)物環(huán)酯肽 Kahalalide B 的合成中采用了兩種合成路線, 均得到了目標產(chǎn)物(Scheme 10)[29].
2.3.2 Kahalalide A 的合成
與上例的 Kahalalide B 相似, 本例目標化合物也是含一個內(nèi)酯鍵的環(huán)肽[30]. 從下面的逆合成分析可以設計出先構建含酯鍵的直鏈肽, 最后以酰胺鍵的形式關環(huán)(Scheme 11).
與上不同的是, 本合成采用固相保險型 linker 載體, 先將Phe4與磺酸型樹脂鍵合, 經(jīng)幾步縮合得到五肽中間體 7. 脫除 7 中 Thr 側鏈 t-Bu 后使 OH 游離, 以便與 Ser7生成酯鍵. 隨后再接上 Thr6及 D-Leu5, 得到直鏈型全序列結構 8. 由于脫除 Fmoc 的試劑六氫吡啶會干擾活化后的磺酰胺 linker 與 D-Leu5 的氨基之間的氨解(最后一步)反應, 所以要在活化磺酰胺鍵之前先使 D-Leu5 上的Fmoc 轉化為 Trt, 成為中間體 9. 然后用 ICH2CN 將磺酰胺的 N 原子烷基化, 使保險 linker 活化. 再用 TFA 脫除N 端的 Trt, 得環(huán)化前體 10. 最后在 DIEA 作用下發(fā)生分子內(nèi)氨解 , 同 時 切 除 樹 脂 得到產(chǎn)物 Kahalalide A (Scheme 12).
2.3.3 自動誘導肽 AIP 的合成
本例合成的目標化合物 AIP (auto-inducing peptide, 自動誘導肽)為側-尾以酯鍵成環(huán)的化合物. 該合成策略的特點是: (1)以酰肼為特殊裂解型 linker; (2)在 linker 上首先鍵合的不是肽鏈 C 末端的第一個殘基, 而是第二個殘基; (3) C 端第一個殘基與肽鏈中間 Ser 殘基的側鏈OH 以酯鍵相連. 設計此種合成方式的依據(jù)在于酰化苯肼 linker 對于肽合成中的反應條件耐受性很強, 甚至在酸、堿環(huán)境中也很穩(wěn)定. 然而此種 linker 結構對氧化條件, 如 Cu2＋, I2, NBS 等非常敏感, 極易受到親核基團的進攻而裂解. 因此, Ser 側鏈上殘基的 NH2可以方便地對酰肼 linker 進行分子內(nèi) SN2 反應, 形成酰胺鍵, 同時切除樹脂(Scheme 13)[31].
2.3.4 噁唑酮酯交換法
Heimgartner 等[32]設計了一種名為“直接酰胺環(huán)化(direct amide cyclization)”的合成路線, 制備了由 α,α-雙取代殘基組成的酯環(huán)肽. 其原理是直鏈肽 C 端的二甲基酰胺結構在無 水 HCl 催 化 下 , 先生成一個“azirine/oxazolone”過渡態(tài) 11 及 12. 后者受到同分子鏈N 端羥基的進攻, 使 oxazolone 五元環(huán)解體, 同時與 OH形成分子內(nèi)酯鍵(Scheme 14).
從中可以看出, α,α-雙取代氨基酸的介入是非常重要的, 它們確保了肽鏈 N 端羥基向 C 端的接近, 利于酯環(huán)的形成. Koch 等[33]利用此方式合成了一些酯環(huán)肽 19, 環(huán)化產(chǎn)率達 46% (Scheme 15).
2.3.5 Ugi 反應衍生法
以醛、乙腈羧酸酯、胺三種組分(四種功能基)為底物進行的 Ugi 反應, 也可以得到含一個酯鍵的酯環(huán)肽產(chǎn)物. 其中, 先由 CHO, NC, NHR 三種功能基縮合, 生成噁唑中間體 20. 再經(jīng)分子內(nèi)羧酸酯誘發(fā)的重排, 經(jīng)螺烷型雙噁唑中間體 21, 最后生成環(huán)酯鍵(Scheme 16) [34].
3 DKP 環(huán)肽衍生物合成
3.1 二肽酯的分子內(nèi)氨解
無論是均相溶液法制備的二肽酯, 還是以酯鍵為linker 的固相載體上的二肽, 當 N 端的保護基被脫除后, 在弱堿或 HOAc 的催化下很容易發(fā)生游離 NH2 對分子內(nèi)的 C 末端酯鍵的氨解反應(Scheme 17).
值得指出的是上述反應在經(jīng)典的以芐酯鍵為 linker的固相肽合成中是一個可導致(三肽以上的)全合成失敗的嚴重副反應. 我們[35]正是利用這個副反應, 以 Pac 樹脂為載體制備了多種收率理想的 DKP 環(huán)二肽產(chǎn)物(Scheme 18)
3.2 BAL 樹脂為載體的二肽分子內(nèi)環(huán)化
固相生成 DKP 的方式一般基于 DKP 前體的羧基與樹脂的 linker 以酯鍵形式直接相連, 因此氨基進攻酯鍵發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化時形成 DKP 并同時從樹脂上切割. 而以 BAL 樹脂為載體的 DKP 合成是通過 linker 與 DKP前體的氨基相連, 所以是先形成 DKP, 后進行樹脂切割, 即兩步反應分開進行. 這樣, 在生成 DKP 后, 通過洗滌除去溶液中的雜質(zhì), 切割后得到高純度的產(chǎn)物[36](Scheme 19).
3.3 醛與氨基酸的還原烷基化途徑合成 DKP 衍生物
連在 Wang 樹脂上的第一個氨基酸的 NH2與相應的醛先縮合成 Schiff 堿, 后者在還原劑 Na(OAc)3BH 作用下, 生成N烷基化中間體22. 隨后用另一個Boc-氨基酸對 22 的仲胺進行�；� 23. 脫除后者的 Boc 后再于甲苯中加熱, 發(fā)生分子內(nèi)氨解并同時切除樹脂, 得到 N 上有取代的 DKP 產(chǎn)物[37] (Scheme 20). 除了上面的 Na(OAc)3BH 外, 還可以使用 NaCNBH3 為還原劑, 固相載體可用 PAM 樹脂代替較昂貴的Wang 樹脂, 得到了收率更滿意的產(chǎn)物[38].
3.4 N,N'-雙取代 DKP 衍生物的合成
用 2-硝基苯磺酰氯對樹脂上第一個氨基酸的 NH2進 行 臨 時保護 , 剩 下一個 H 原 子 確 保 在 隨 后 的Mitsunobu 反應得到 N 單取代產(chǎn)物 24. 脫除 N 上磺酰基后再被溴乙�；�, 得中間體25. 經(jīng)SN1反應將25轉化為N 取代的甘氨酰二肽 26. 后者在 TFA-H2O 催化下生成直鏈二肽 27 及 DKP 環(huán)二肽 28 的混合物. 在三氟乙酸酐(TFAA)/DCM及溫熱下, 27可完全轉化為目標產(chǎn)物28[39](Scheme 21).
3.5 Ugi 反應途徑合成 DKP 衍生物
Ugi 反應是用醛、酸、胺及異腈 4 種反應底物進行多組分一鍋反應(MCR). 由于反應底物類型多, 因此產(chǎn)物具有很好的結構多樣性. 尤其是固相反應方式, 可以簡化反應后的純化過程, 即除了掛在固相載體上的縮合產(chǎn)物外, 其它剩余的幾種反應物均可過濾除去[40](Scheme 22).
3.6 并環(huán) DKP 衍生物的合成
許多高活性的 DKP 型天然產(chǎn)物及人工設計合成的DKP 衍生物的結構遠比上述合成例的產(chǎn)物要復雜得多, 它們往往具有并環(huán)的骨架結構. 此類化合物的合成已有一些文獻報道[41,42]. 下面的合成是脯氨酸的五元環(huán)為制備 DKP 并環(huán)前的支架結構. 首先將兩端保護的羥脯氨酸 Fmoc-Hyp-OMe 的側鏈 OH 與 Ellman 樹脂的雙鍵發(fā)生加成反應而鍵連上. 隨后使 Hyp 殘基上 α-碳烷基化, 再用第二種氨基酸與 Hyp 接成二肽. 脫除第二位殘基的N 保護后, 使游離 NH2進攻 Hyp 的甲酯鍵, 發(fā)生分子內(nèi)氨解, 生成 DKP 并環(huán)結構(Scheme 23) [42].
3.7 烯側鏈 DKP 的合成
首先用廉價的氯乙酸與游離的天冬氨酸縮合, 再用氨水與氯發(fā)生 SN2 反應制得 Gly-Asp 二肽. 后者在酸性甲醇環(huán)境中使 Asp 的羧基甲�；�, 最后經(jīng)分子內(nèi)氨解生成 DKP 型產(chǎn)物. 全部合成的最大特點是不用經(jīng)典的肽縮合試劑, 也沒有任何保護與脫保護的反應, 因此成本低、適于大生產(chǎn)[43] (Scheme 24).
3.8 肽雙分子縮合法
前面介紹的各種合成中, 一般均要經(jīng)歷二肽分子內(nèi)氨解形成 DKP 環(huán)途徑. 其實肽作為單體的雙分子縮合也是一種合成 DKP 結構的合理方式. 因為這種方式得到的 DKP 衍生物具有 N,N'-雙取代的結構特點. 此種合成需要反應物的 C 末端含有 Gly 殘基, 因為其它殘基的α-碳原子上均有側鏈取代, 位阻加大不易發(fā)生雙分子反應. 研究發(fā)現(xiàn), 許多寡肽經(jīng)雙分子縮合形成的DKP雙倍肽鏈結構后, 其原有的活性可獲得提高. 因此含DKP環(huán)的 雙 側 肽化合物的 設 計 與合成具有一定 意 義 [44](Scheme 25).
3.9 螺環(huán) DKP 串連肽的合成
以羥脯氨酸(29)為原料, 經(jīng)多步轉化生成關鍵中間體 30, 再將 30 分別轉換為氨基組分 31 及羧基組分 32. 兩個組分縮合為二肽 33 之后, 脫除由 32 衍生的結構段上的 Boc, 使仲氨基游離得 DKP 前體結構 34. 隨后在堿或酸催化下, 發(fā)生二肽分子內(nèi)氨解, 生成一種五元環(huán)與DKP 連為螺環(huán)的產(chǎn)物 35. 這就是螺環(huán) DKP 串連肽中的一個單元結構[45] (Scheme 26).
4 含醚橋環(huán)肽合成
從橋連結構看, 醚環(huán)肽又分為脂-芳混醚型及芳醚型兩大類, 并以前者為多數(shù). 根據(jù)醚橋的生成方式, 有Scheme 27 所示反應途徑.
在合成策略上與酯環(huán)肽相似, 醚環(huán)肽的合成順序上也存在兩種情況: (1)先制備肽鏈主體結構, 最后以醚鍵的生成實現(xiàn)合環(huán). (2)先制備含醚結構的片段, 最后以酰胺鍵(或其它鍵)的生成實現(xiàn)合環(huán).
4.1 混醚環(huán)肽合成
天然產(chǎn)物醚環(huán)肽 Sanjoinine G1 的骨架上含有兩個肽鍵及一個芳烴/烷烴混合醚鍵. 在逆合成分析這個十四元環(huán)的目標結構時, 可以確定兩個成環(huán)鍵位置 a 與 b (Scheme 28). 因此存在兩條路線可以完成此環(huán)肽的合成.
路線(a), 先制備含有混醚結構的直鏈肽, 最后進行酰胺鍵方式關環(huán)(Scheme 29)[46].
路線(b), 先制備肽鏈, 最后經(jīng) SNAr 反應使氟代苯與側鏈上的仲醇之間脫一分子 HF 生成混醚鍵(Scheme 30)
利用 Mitsunobu 反應制備 混醚環(huán)擬肽(Scheme 31)[47].
利用肽鏈中 Tyr 的側鏈酚羥基與分子內(nèi)另一位點側鏈上的溴原子之間的SN2反應生成混醚環(huán)肽是比較簡便的合成方式(Scheme 32)[48].
王德心等[49]以肽鏈 N 端的溴乙酰及 C 端的 Tyr 為兩個橋頭, 經(jīng)固相肽合成方式首先制備含這兩種橋頭結構的直鏈肽中間體, 最后以 K2CO3為堿催化劑方便地構建了一些混醚環(huán)肽產(chǎn)物(Scheme 33).
與上例合成不同的是將鹵原子連在苯環(huán)上, 羥基位于同分子的烷基鏈上. 由于對位硝基的影響, F 原子有較高的反應活性, 用 K2CO3的堿性條件即可完成混醚鍵環(huán)合(Scheme 34)[50].
4.2 芳醚環(huán)肽合成
首先以具有鄰硝基氟苯取代的異腈及其它的三種組分進行 4CR (four-component reaction)方式的 Ugi 縮合反應, 制得含酚羥基及鄰硝基氟苯的直鏈肽中間體. 隨后在堿催化下發(fā)生分子內(nèi) SNAr 反應, 得到芳醚環(huán)肽產(chǎn)物(Scheme 35)[51].
除了上例合成中引入鄰、對位 NO2或 CN 可以活化芳鹵原子的活性外, 釕試劑與氯苯形成 η6-芳烯絡合物過渡態(tài)的方式提高苯環(huán)上氯原子的反應活性. 具體路線是先使 Boc-Phe(4-Cl)OH 與釕試劑形成活化絡合物 36, 然后在羧基方向組裝肽結構得中間體 37, 后者在 Na 試劑催化下, 除去 HCl 生成芳醚鍵. 最后經(jīng)光解反應除去絡合的釕鹽, 得目標產(chǎn)物(Scheme 36)[52].
還可用 Cs2CO3/DMF 與釕試劑-氯苯絡合物反應完成此步環(huán)合(Scheme 37)[53].
5 單硫及多硫醚環(huán)肽合成
除了前面介紹的經(jīng)典二硫橋以外, 屬于硫醚橋結構的還有單硫醚橋—S—、亞甲二硫醚橋—SCH2S—及連三硫橋—S—S—S—等形式. 其中以單硫橋較為多見, 它們又分為烷烴單硫醚及芳烷混硫醚兩種. 因各種硫醚橋的結構不同, 制備方法可分為以下幾種: (1)含單硫醚片段的其它鍵(以 CONH 為主)的環(huán)合; (2) SN2 反應方式, 以肽鏈中 Cys 殘基側鏈的巰基為—S—的前體結構, 以同分子內(nèi)的鹵原子為親核基團; (3) SNAr 反應方式, 以Cys 側鏈的巰基及同分子內(nèi)芳環(huán)上的氟原子為環(huán)合反應的橋頭組分.
5.1 預制單硫醚中間體的環(huán)肽合成
Tabar 等[54]建立了一條可以制備產(chǎn)物的立體選擇性較高的合成路線. 以 D-絲氨酸為原料, 先后經(jīng)兩側保護、羥基甲磺酸酯化、碘取代得到重要中間體側鏈碘代丙氨酸(40). 后者在堿存在下, 與雙保護的半胱氨酸發(fā)生 SN2 反應, 得到一對產(chǎn)率差別明顯的以單硫醚為橋的雙丙氨酸衍生物 Lanthionine (41). 后者作為一個關鍵構件往往用于一類名為 Lantibiotics 的天然產(chǎn)物肽合成(Scheme 38). Tabar 實驗室則將 41 用于天然產(chǎn)物 Nisin C環(huán)類似物 45 的固相合成(Scheme 39)[55].
5.2 以 SN2 反應方式關環(huán)制備單硫醚環(huán)肽
以SN2反應方式關環(huán)是制備單硫醚環(huán)肽最常用的策略. 其中提供硫原子的結構多為肽鏈中的 Cys 殘基, 而含鹵原子的結構為側鏈衍生的溴烷鏈或 N 端溴乙酰(或氯乙酰). 堿催化是必需的反應條件, 一般的叔胺[三乙胺、N-甲基嗎啉或 DBU (1,8-diazabicyclo[5.4.0]-undec-7- ene)]足以保證 SN2 反應的進行. DBU 催化的關環(huán)見 Eq. 1[56]; 三乙胺/水催化的關環(huán)見 Eq. 2[57].
5.3 在肽鏈 N 端引入對位硝基氟代苯
由于硝基的拉電子效應, 使對位 F 原子活化, 足以與 SH 發(fā)生 SNAr 反應, 生成芳烷混硫醚鍵(Scheme 40)[58].
5.4 Michael 加成法
在肽鏈中適當位點的 Ser 殘基上進行消除反應, 生成脫氫丙氨酸(Dha), 然后與肽鏈上的游離 SH 發(fā)生Michael 加成得到單硫醚環(huán)肽, 最后再脫除側鏈保護及切除載體. 此種方式又被認為是模擬生物合成的一種途徑(Scheme 41)[59].
5.5 利用 N 端的溴乙酸對二硫鍵型 linker 進行環(huán)化裂解
本例合成的特點是利用 N 端的溴乙酸對二硫鍵型linker 進行環(huán)化裂解反應. 產(chǎn)物具有典型的 β-turn 擬肽結構(Scheme 42)[60].
5.6 生成亞甲二硫醚(SCH2S)鍵
肽鏈中含兩個巰基是制備連二硫鍵環(huán)肽的結構基礎. 但如果在相轉移催化劑四丁基氟化銨存在下, 可以活化溶劑 CH2Cl2, 使后者生成卡賓并介于兩個硫原子之間, 生成亞甲二硫醚(SCH2S)鍵(Eq. 3)[61].
5.7 連三硫橋環(huán)肽的合成
連三硫橋環(huán)肽存在一些天然產(chǎn)物中, 它們具有的抗菌及細胞毒活性已經(jīng)引起化學家的關注. 制備這種環(huán)肽的基本原理是以含有兩個 Cys 殘基的肽為底物結構, 其中的一個Cys上的巰基先與專門的硫醚化試劑生成混連二硫鍵或混連三硫鍵. 然后再接受分子內(nèi)另一個巰基的進攻, 發(fā)生硫交換反應, 生成連三硫鍵環(huán)肽. 以 TBPI (N,N'-硫雙鄰苯二甲酰亞胺)為硫醚交換劑見 Scheme 43[62]. 以 Mpa(甲氧酰連三硫丙酸)為硫醚交換劑, 見 Scheme 44[63].
5.8 多連硫醚環(huán)肽的合成
近年發(fā)現(xiàn)一些含有5個甚至更多的連硫醚的天然產(chǎn)物, 因此化學家開始對多連硫醚環(huán)肽的合成進行了研究. 比較有代表性的一種方法就是先構建含有兩個半胱氨酸殘基的肽鏈 46. 然后與一種商品可購的硫化試劑BTH ([Bu4N]2S6)在水溶液中反應, 可以方便地制得從二硫橋到五硫橋的環(huán)肽 47. 其中 BTH 的用量及反應時間不同, 可以控制硫橋的長度(Eq. 4)[64].
6 含烯鍵環(huán)肽合成
已知的方法中, 多數(shù)是將含烯鍵構件引入肽鏈, 然后再進行分子內(nèi)關環(huán)復分解(RCM)反應或分子內(nèi) Heck反應, 實現(xiàn)環(huán)合
6.1 分子內(nèi) RCM 反應方式
該方式的先決條件是先組建肽鏈上兩個橋頭前體均含雙鍵的中間體. 后者在有機釕(Ru)型的Grubbs試劑作用下發(fā)生分子內(nèi) RCM 反應, 使肽鏈環(huán)化.
6.1.1 雙側鏈 O 原子上烯丙醚的 RCM 環(huán)合
肽鏈上的兩個 Ser, Thr 或 Tyr 殘基上的羥基經(jīng)適當?shù)霓D化反應(如 SN2, SNAr 或 Mitsunobu 反應)引入兩個烯丙側鏈. 然后經(jīng) Grubbs 試劑催化, 發(fā)生分子內(nèi) RCM 反應生成烯環(huán)肽(Scheme 45)[65].
6.1.2 兩個殘基 α-碳上烯戊基側鏈的 RCM 環(huán)合
從先預制的含烯丙基側鏈的氨基酸或其衍生物為單體, 參與肽鏈組裝后經(jīng) Grubbs 試劑催化, 得到相應的烯環(huán)肽[66](Eq. 5)
6.1.3 肽鏈中兩個 N 原子上烯丁基間的 RCM 環(huán)合
肽鏈中兩個 N 原子上烯丁基間的 RCM 環(huán)合見Scheme 46[67].
6.1.4 擬肽鏈上不對稱雙烯的 RCM 環(huán)合
已進入臨床的 HCV 蛋白酶抑制劑 BILN-2061 是一種擬肽環(huán)合的化合物. 其環(huán)上的雙鍵橋就是在側鏈庚烯與側鏈環(huán)己烯之間的 RCM 反應形成的, 此反應生產(chǎn)批量已高達 400 kg 以上[68] (Scheme 47).
6.2 經(jīng) Heck 反應合成烯環(huán)肽
烯或炔鍵上的不飽和碳原子發(fā)生芳烴取代是 Heck反應的特點. 因此在肽鏈的不同位置分別引入烯(或炔)鍵及碘代苯, 作為合環(huán)的前體結構. 然后在鈀催化劑作用下, 發(fā)生分子內(nèi) Heck 反應, 生成含烯(或炔)橋的環(huán)肽產(chǎn)物.
烯丁酰與對甲酰碘苯的鍵合見 Scheme 48[69]; 烯丙酰與間碘代芐胺的鍵合見 Scheme 49[70].
7 剛性橋環(huán)肽合成
7.1 三取代環(huán)戊烷為橋
首先將三取代環(huán)戊烷通過羧基與羥基樹脂鍵連, 隨后先后在互為鄰位的羥基及疊氮上分別組裝肽鏈的 N端段及 C 端段. 最后進行 COOH 與 NH2縮合成為含環(huán)戊烷剛性環(huán)的內(nèi)酰胺關環(huán)肽[71] (Scheme 50).
7.2 含三嗪環(huán)結構的環(huán)肽
用正交保護方式的 Fmoc-Lys(Boc)作為組裝肽鏈及環(huán)化的基礎. 首先將 Fmoc-Lys(Boc)通過適當?shù)拈g隔(Spacer)結構與固相載體連接成為 48. 然后脫除 Fmoc, 進行直鏈肽序列組裝得到中間體 49. 脫除肽鏈 N 端的Fmoc 之后, 將游離的 NH2 與三氯三嗪上的一個氯原子進行 SN2 反應. 雖然三氯三嗪分子中的 Cl 非�；顫�, 但因固相載體的假稀釋效應, 使三氯三嗪分子只有一個Cl與肽的NH2反應, 得到50. 隨后脫除賴氨酸側鏈上的Boc, 使NH2游離, 成為51. 在堿的作用下, 三嗪環(huán)上的第二個 Cl 原子與賴氨酸側鏈 NH2發(fā)生分子內(nèi)的 SN2 反應, 生成三嗪環(huán)嵌入的環(huán)肽 52[72] (Scheme 51).
7.3 并四氫呋喃雙環(huán)結構的環(huán)肽
首先把剛性結構的雙并四氫呋喃先與肽鏈結合, 最后由支架兩側的氨基酸殘基完成內(nèi)酰胺環(huán)合. 具體合成以戊糖衍生物 53 為原料, 經(jīng)幾步轉化反應得到二并四氫呋喃支架型中間體 54. 隨后與二肽樹脂鍵合. 再將二并四氫呋喃 N 端的疊氮基轉化為 NH2, 以便與 FmocAsp(O-t-Bu)-OH 縮合, 制得環(huán)化前體結構 55. 最后用經(jīng)典的肽縮合條件完成含 RGD 片段的環(huán)肽制備(Scheme 52)[73].
7.4 對二芐介入的環(huán)肽
首先以雙倍物質(zhì)的量的氨基酸對 α,ω-二胺進行雙端�；�, 繼以脫除兩端氨基酸上 N 保護基, 得到關鍵中間體56. 然后進行對位(或間位)二溴芐與56的兩個NH2之間的 SN2 反應(分兩步), 最終得到二芐結構嵌入的雙仲胺環(huán)肽 57[74] (Scheme 53).
7.5 金剛烷介入的酯環(huán)肽
金剛烷介入的酯環(huán)肽見 Scheme 54[75].
8 仲、叔胺橋環(huán)肽合成
仲、叔胺橋環(huán)肽合成主要有以下三種方法: 首先預制含仲(叔)胺的中間體, 后進行主鏈環(huán)合[76,77]; ArF 及H2NAr 之間的鍵合關環(huán)[78]以及溴乙酰與側鏈上 NH2 的鍵合關環(huán)
9 Freidinger 局部環(huán)肽
DKP 是頭-尾相連的內(nèi)酰胺環(huán)二肽化合物. 相比之下, Freidinger是一個殘基的α-碳原子與右側相鄰殘基的氮原子橋連的另一類環(huán)二肽化合物(圖 3).兩者均可在肽鏈中增加了剛性結構因素, 后者的結構多樣性遠遠超過 DKP 環(huán)肽, 因此有利于開發(fā)結構上更像藥(drug like)的活性化合物.
合成 Freidinger 環(huán)肽的方法非常廣泛, 本文作者已經(jīng)系統(tǒng)地進行了歸納[80]. 從宏觀策略講, Freidinger 環(huán)肽的合成基本由 Scheme 55 所示 4 種路線實現(xiàn).
10 其它結構環(huán)肽合成
10.1 聯(lián)苯橋環(huán)肽
與普通有機小分子聯(lián)苯化合物合成相似, 此類環(huán)肽的環(huán)合方法也是以兩個碘代苯(為橋頭)之間的 Suzuki 反應、Ullmann 反應或氧化偶聯(lián)等反應為多見[81].
10.2 Mannich 堿環(huán)肽
肽鏈上如果含有 Tyr 殘基, 其酚羥基的 α-位可以作為活潑氫的供體與胺及醛發(fā)生 Mannich 縮合. 實際上肽鏈 N 端氨基即是現(xiàn)成的胺組分, 環(huán)合時只需外加的醛構件即可制得 Mannich 堿型環(huán)肽[82].
10.3 PNA 環(huán)肽
PNA 是以氨乙基-(N-堿基乙酰)-甘氨酰為殘基串連形成的雜交肽. 其環(huán)化策略可分為先制備環(huán)肽鏈, 后鍵連堿(Scheme 56)[83]及先制備含堿基的直鏈肽, 后環(huán)合(Scheme 57) [84]兩種.
10.4 雙 loop 環(huán)肽
許多天然產(chǎn)物肽及人工合成的先導活性肽以含有兩個鏈環(huán)(loop)為結構特征. 這些化合物的橋連結構各有不同, 在同一分子內(nèi)兩個 loop 之間共用的橋結構(內(nèi)側橋)與外側橋的橋結構往往是不相同的. 多數(shù)情況下, 內(nèi)側橋由二硫鍵或雜環(huán)構成; 外側橋往往是酰胺鍵或酯鍵結構(Scheme 58).
10.3.1 天然產(chǎn)物肽 Triostin A 類似物的合成
首先制備含 Cys 的全保護酯四肽 76. 然后的反應順序是兩個分子的 76 進行酰胺鍵縮合成為 77, 分子內(nèi)形成二硫鍵(內(nèi)側橋)得到中間體 78. 最后一對橋頭形成酰胺鍵(外側橋), 完成雙 loop 79 的構建(Scheme 59)[85].
10.3.2 天然產(chǎn)物肽[Ala7]-Phalloidin 的合成
本合成例目標化合物是以吲哚環(huán)為內(nèi)側橋, 以酰胺鍵為外側橋的雙loop環(huán)肽. 主要的合成步驟是先制備含內(nèi)側橋的片段, 然后延長外側鏈. 接下來先使右側CONH 關環(huán), 再形成左側內(nèi)酰胺鍵, 構成雙 loop 產(chǎn)物[86].
11 小結
統(tǒng)計表明, 盡管直鏈肽的數(shù)量遠遠多于環(huán)肽, 但目前已有的肽類先導化合物、用于臨床試驗的肽類候選藥及已經(jīng)上市的肽類藥物中, 環(huán)肽卻占一半以上. 由此表明, 在新藥研發(fā)中, 環(huán)肽的成功率遠遠高于直鏈肽. 因此, 設計、合成結構多樣的環(huán)肽不但進一步豐富肽化學的內(nèi)容, 而且將會促成更多肽類新藥的出現(xiàn).
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