多肽是由多個氨基酸通過肽鍵連接而形成的一類化合物，普遍存在于生物體內，迄今在生物體內發(fā)現(xiàn)的多肽已達數萬種。多肽在調節(jié)機體各系統(tǒng)、器官、組織和細胞的功能活動以及在生命活動中發(fā)揮重要作用，并且常被應用于功能分析、抗體研究、藥物研發(fā)等領域。隨著生物技術與多肽合成技術的日臻成熟，越來越多的多肽藥物被開發(fā)并應用于臨床。
多肽修飾種類繁多，可以簡單劃分為后修飾和過程修飾（利用衍生化的氨基酸修飾），從修飾位點不同則可分為N端修飾、C端修飾、側鏈修飾、氨基酸修飾、骨架修飾等（圖1）。作為一種改變肽鏈主鏈結構或側鏈基團的重要手段，多肽修飾可有效改變肽類化合物的理化性質、增加水溶性、延長體內作用時間、改變其生物分布狀況、消除免疫原性、降低毒副作用等。本文主要介紹幾種最主要的多肽修飾策略及特點。
1、多肽化學修飾之環(huán)化
環(huán)肽在生物醫(yī)學中具有諸多應用，而且許多具有生物活性的天然多肽都是環(huán)狀多肽。由于環(huán)肽往往比線性肽更具有剛性，因此它們對消化系統(tǒng)具有極強的抵抗力，可以在消化道中存活，并且對靶受體表現(xiàn)出更強的親和力。環(huán)化是合成環(huán)狀多肽最直接的途徑，尤其對于結構骨架較大的多肽。根據環(huán)化方式可以分為側鏈-側鏈式、終端-側鏈式、終端-終端式（頭尾相連式）。
（1）側鏈-側鏈式（sidechain-to-sidechain）
側鏈-側鏈式環(huán)化最常見類型是半胱氨酸殘基間的二硫橋接，引入這種環(huán)化的方法是通過一對半胱氨酸殘基脫保護然后氧化構成二硫鍵。通過選擇性地移除巰基保護基可以實現(xiàn)多環(huán)的合成。環(huán)化既可以在解離后的溶劑里完成，也可以在解離前的樹脂上完成。由于樹脂上的多肽不易形成可環(huán)化的構象，因此在樹脂上環(huán)化可能要比在溶劑中環(huán)化低效。側鏈-側鏈式環(huán)化的另一種類型是在門冬氨酸或谷氨酸殘基與基礎氨基酸之間形成酰胺結構，它要求多肽無論是在樹脂上還是解離后，側鏈保護基都必須能夠選擇性移除。第三種側鏈-側鏈式環(huán)化是通過酪氨酸或對羥基苯甘氨酸形成聯(lián)苯醚。天然產物中這種類型的環(huán)化只在微生物產物中存在，而且環(huán)化產物往往具有潛在藥物價值。制備這些化合物需要獨特的反應條件，因此不常用于常規(guī)多肽的合成。
（2）終端-側鏈式（terminal-to-sidechain）
終端-側鏈式環(huán)化通常涉及C末端與賴氨酸或鳥氨酸側鏈的氨基，或者N末端與門冬氨酸或谷氨酸側鏈。還有一些多肽環(huán)化是通過末端C與絲氨酸或蘇氨酸側鏈形成醚鍵而構成。
（3）終端-終端式或頭尾相連式（head-to-tail）
鏈狀多肽可以在溶劑中環(huán)化或者固定在樹脂上通過側鏈環(huán)化。在溶劑中環(huán)化應該用低濃度的多肽以避免多肽的低聚反應。頭尾相連式合成環(huán)狀多肽的產率取決于鏈狀多肽的序列。因此，在大規(guī)模制備環(huán)狀多肽前，首先應該創(chuàng)建可能的鏈狀先導多肽庫，然后進行環(huán)化以尋找能達到最佳結果的序列。
2、多肽化學修飾之N-甲基化
N-甲基化最初出現(xiàn)在天然多肽中，并被引入到多肽合成中以阻止氫鍵的形成，進而使得多肽更加耐受生物降解和清除。利用N-甲基化的氨基酸衍生物合成多肽是最主要的方法，另外也可利用N-(2-硝基苯磺酰氯)多肽-樹脂中間體與甲醇進行Mitsunobu反應，該方法已被用于制備含有N-甲基化氨基酸的環(huán)狀多肽庫。
3、多肽化學修飾之磷酸化
磷酸化是自然界中最常見的翻譯后修飾之一。在人類細胞中，超過30％的蛋白質被磷酸化。磷酸化，尤其是可逆磷酸化，在控制許多細胞過程中起重要作用，如信號轉導、基因表達、細胞周期和細胞骨架調節(jié)以及細胞凋亡。
磷酸化可以在各種氨基酸殘基上觀察到，但最常見的磷酸化目標是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基[4]。磷酸酪氨酸、磷酸蘇氨酸和磷酸絲氨酸衍生物既可在合成中引入到多肽也可在多肽合成以后形成。使用可選擇性移除保護基團的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基可以實現(xiàn)選擇性磷酸化。一些磷�；噭┮部赏ㄟ^后修飾在多肽中引入磷酸基團[5]。近年來，有學者使用化學選擇性的Staudinger-亞磷酸酯反應實現(xiàn)了賴氨酸的位點特異性磷酸化（圖3）
4、多肽化學修飾之豆蔻�；妥貦磅；�
用脂肪酸酰化N末端可以讓多肽或蛋白質與細胞膜結合。N末端上豆蔻�；男蛄锌梢允筍rc家族的蛋白激酶和逆轉錄酶Gaq蛋白靶向結合細胞膜。利用標準的偶聯(lián)反應即可將豆蔻酸連接到樹脂-多肽的N末端，生成的脂肽可在標準條件下解離并通過RP-HPLC純化。
5、多肽化學修飾之糖基化
多肽化學修飾之糖肽類如萬古霉素和替考拉寧是治療耐藥細菌感染的重要抗生素，其他糖肽常被用于刺激免疫系統(tǒng)。另外，由于很多微生物抗原是糖基化的，因此研究糖肽對提高感染的治療效果具有重要意義。另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞細胞膜上的蛋白質表現(xiàn)出異常的糖基化，這使得糖肽在癌癥和腫瘤免疫防御研究中也發(fā)揮著重要作用。糖肽的制備一般利用Fmoc/t-Bu方法。糖基化殘基，比如蘇氨酸和絲氨酸常通過五氟苯酚酯活化的Fmoc保護糖基化氨基酸引入到多肽中。
6、多肽化學修飾之異戊二烯化
異戊二烯化發(fā)生在C末端附近側鏈上的半胱氨酸殘基。蛋白質的異戊二烯化可以提高細胞膜親和性，形成蛋白質-蛋白質相互作用。異戊二烯化的蛋白質包括酪氨酸磷酸酶、小GTP酶、協(xié)同伴侶分子、核纖層和著絲粒結合蛋白。異戊二烯化的多肽可以利用樹脂上的異戊二烯化方法或者引入半胱氨酸衍生物制備[9]。
7、多肽化學修飾之聚乙二醇（PEG）修飾
PEG修飾可用于改善蛋白水解穩(wěn)定性、生物分布和肽的溶解度[10]。在多肽上引入PEG鏈可以改善它們的藥理性質，也可以抑制多肽被蛋白水解酶水解。PEG多肽比普通多肽更容易通過腎小球毛細血管截面，大大減少腎清除率。由于PEG多肽在體內的有效半衰期延長，因此使用更低劑量、更低頻度的多肽藥物便可以維持正常治療水平。但PEG修飾也存在負效應。大量PEG在阻止酶降解多肽的同時也會減少多肽與目標受體的結合。但PEG多肽的低親和力通常被其更長的藥動學半衰期抵消，通過在體內存在更久，PEG多肽有更大可能性被目標組織吸收。因此，PEG聚合物的規(guī)格應該針對最佳結果進行最優(yōu)化設計。另一方面，由于腎清除率降低，PEG多肽會在肝臟累積造成大分子綜合征。因此，當多肽用于藥物測試時需要更加謹慎地設計PEG修飾。
PEG修飾劑常見的修飾基團大致可總結如下：氨基（-Amine）-NH2，氨甲基-CH2-NH2，羥基-OH，羧基-COOH，巰基（-Thiol）-SH，馬來酰亞胺-MAL，琥珀酰亞胺碳酸酯-SC，琥珀酰亞胺乙酸酯-SCM，琥珀酰亞胺丙酸酯-SPA，N-羥基琥珀酰亞胺-NHS，丙酸基-CH2CH2COOH，醛基-CHO（如丙醛-ALD，丁醛-butyrALD），丙烯酸基（-Acrylate）-ACRL，疊氮基-Azide，生物素基-Biotin，熒光素基-Fluorescein，戊二酸基-GA，酰肼基-Hydrazide，炔基-Alkyne，對甲苯磺酸酯基-OTs，琥珀酰亞胺琥珀酸酯-SS等。帶有羧酸的PEG衍生物可以與N末端的胺或者賴氨酸側鏈進行偶聯(lián)。氨基活化的PEG可以與門冬氨酸或者谷氨酸側鏈偶聯(lián)。MAL活化的PEG可以與完全脫保護的半胱氨酸側鏈的硫醇進行偶聯(lián)[11]。PEG修飾劑常見分類如下（注：mPEG即methoxy-PEG，CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH）：
（1）直鏈PEG修飾劑
mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS
（2）雙官能團PEG修飾劑
HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS
（3）分枝形PEG修飾劑
(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL
8、多肽化學修飾之生物素化
生物素可以與親和素或者鏈霉親和素有力結合，結合強度甚至接近共價鍵。生物素標記的肽通常用于免疫測定，組織細胞化學和基于熒光的流式細胞術。標記的抗生物素抗體也可以用來結合生物素化多肽。生物素標記常連接在賴氨酸側鏈或者N末端。通常在多肽和生物素之間使用6-氨基己酸作為紐帶，紐帶能夠靈活結合底物，并且在有空間位阻的情況下能結合地更好。
9、多肽化學修飾之熒光標記
熒光標記可用于追蹤活細胞內多肽，也可用于研究酶和作用機制。色氨酸（Trp）帶有熒光，因此可以被用于內在標記。色氨酸的發(fā)射光譜取決于外圍環(huán)境，隨著溶劑極性降低而降低，這種性質對于檢測多肽結構和受體結合很有用處[12]。色氨酸熒光可以被質子化的門冬氨酸和谷氨酸淬滅，這可能會限制其使用。丹磺酰氯基團（Dansyl）與氨基結合時具有高度熒光，也常被用于氨基酸或蛋白質的熒光標記。
熒光共振能量轉換（FRET）對酶的研究十分有用，應用FRET時，底物多肽常含有一個熒光標記基團和一個熒光淬滅基團。標記的熒光基團會被淬滅劑通過非光子能量傳遞淬滅。當多肽從所研究的酶上解離下來，標記基團就會發(fā)射熒光。
10、多肽化學修飾之籠形多肽
籠形多肽有光學移除性的保護基，光學移除性保護基可以屏蔽多肽與受體的結合。當受到UV照射時，多肽會被活化，恢復與受體的親和力。由于這種光學活化可以根據時間、振幅或者位置來控制，因而籠形多肽可以被用于研究細胞內發(fā)生的反應[13]。最常用于籠形多肽的保護基是2-硝基芐基及其衍生物，它們可在多肽合成中通過保護的氨基酸衍生物而引入。已經發(fā)展的氨基酸衍生物有賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和酪氨酸。而門冬氨酸和谷氨酸衍生物由于在多肽合成和解離過程中很容易環(huán)化，因此并不常用。
11、多肽化學修飾之多聚抗原肽（MAP）
短肽通常不具有免疫性，必須和載體蛋白耦合才能產生抗體。多聚抗原肽（MAP）由多個連接到賴氨酸核的相同多肽構成，能特異性表達高效免疫原，可用來制備肽-載體蛋白耦聯(lián)體。MAP多肽可以在MAP樹脂上利用固相合成法分步合成。然而，不完整的耦合會在一些分支上產生遺失或截斷肽鏈，因而表現(xiàn)不出原本MAP多肽的性質。作為替代性的方法，多肽可以單獨制備和純化然后再耦聯(lián)到MAP上[14]。連接到多肽核心上的多肽序列是明確的，并且很容易通過質譜表征。
結語：
多肽修飾是一種設計多肽的重要手段，經過化學修飾的多肽不僅可以維持較高的生物活性, 而且能夠有效地避免免疫原性和毒性方面的缺點，同時化學修飾可以賦予多肽一些新的優(yōu)良性能。近年來，利用C-H活化的手段對多肽進行后期修飾的方法也得到了迅猛的發(fā)展，并取得了許多重要成果。后期，筆者也將對這一領域進行綜述，敬請期待！
