摘要：自組裝多肽是指能夠在一定條件下, 通過(guò)π-π堆積、靜電相互作用等分子間作用力, 形成組裝體的多肽類材料. 此類材料具有良好的生物相容性和可控性, 能夠形成顆粒、纖維和凝膠等納米結(jié)構(gòu), 發(fā)揮特定的形貌學(xué)功能, 廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域. 為了滿足藥物遞送、疾病診療等需求, 需要在多肽上進(jìn)行修飾. 由于多肽的組裝特性及其自身的生物功能, 修飾后的組裝肽在組裝能力和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面更具有優(yōu)勢(shì), 所以如何進(jìn)行自組裝肽的功能化修飾一直是研究熱點(diǎn). 多肽修飾位點(diǎn)一般在兩端的羧基和氨基, 以及氨基酸側(cè)鏈上的活性基團(tuán). 為了降低修飾難度或避免影響目標(biāo)分子的生物活性, 可以通過(guò)連接單元來(lái)修飾某些功能基團(tuán). 因此根據(jù)修飾方法可以分為直接修飾和間接修飾. 綜述了近期自組裝多肽的功能化修飾方法及相關(guān)應(yīng)用.
自組裝生物材料由于其在生物醫(yī)學(xué)成像、藥物遞送及疾病診療方面的應(yīng)用潛力受到廣泛關(guān)注, 成為近年研究中的前沿領(lǐng)域之一[1-2]. 蛋白質(zhì)、多肽等生物分子自組裝過(guò)程廣泛存在于自然界生物體的生理活動(dòng)中, 其組裝體具有良好的生物相容性, 以及在生物體內(nèi)的可控組裝功能, 能夠?qū)崿F(xiàn)在病灶區(qū)域的聚集和滯留. 近幾十年來(lái), 學(xué)者們?cè)趯?duì)氨基端、天然多肽、蛋白質(zhì)的認(rèn)識(shí)中得到了啟示, 構(gòu)建了自組裝多肽[3]. 典型的自組裝多肽KLVFF, 其序列來(lái)自于阿爾茨海默癥相關(guān)的β-淀粉樣蛋白[4-5], 除此以外, 人們從天然蛋白中篩選了許多有自組裝潛力的多肽序列. 多肽自組裝的推動(dòng)力主要包括π-π堆積、靜電相互作用、氫鍵和疏水作用等, 這些因素使得多肽組裝形成特定的納米結(jié)構(gòu)[6]. 學(xué)者們?cè)趯?duì)天然自組裝多肽的研究發(fā)現(xiàn), 序列為FF的二肽具有良好的自組裝能力, 這是由于側(cè)鏈苯環(huán)的π-π堆積作用, 學(xué)者們根據(jù)FF為組裝核心設(shè)計(jì)出了功能各異的自組裝分子. 組裝體中多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)通常為β-片層和α-螺旋, 而組裝體的形貌多樣, 用途也不同[7]. 此外, 自組裝多肽具有組裝誘導(dǎo)滯留效應(yīng)(AIR)[8], 即多肽在生物體中由于內(nèi)源性的因素發(fā)生組裝, 可以長(zhǎng)效滯留在病灶區(qū)域, 增強(qiáng)聚集和效果, 降低對(duì)正常組織的毒性. 同時(shí), 有些小分子本身也有自聚集的傾向, 比如含有大共軛π-體系的葉綠素分子[9-10], 通過(guò)修飾到自組裝多肽上, 既可以發(fā)揮成像作用還可以增強(qiáng)目標(biāo)分子組裝能力.
近年學(xué)科融合的發(fā)展使得自組裝多肽更多的被應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[11], 自組裝多肽特點(diǎn)啟發(fā)我們利用多肽自組裝策略解決當(dāng)前小分子藥物存在的問(wèn)題, 例如對(duì)病灶區(qū)域識(shí)別能力和富集能力差、體內(nèi)循環(huán)中容易被降解、對(duì)于正常細(xì)胞和組織的毒副作用比較大等, 因此如何將這些功能性分子修飾在多肽上是一個(gè)值得我們研究的問(wèn)題. 為了使自組裝多肽可以在更廣泛的領(lǐng)域應(yīng)用, 在選擇修飾方法的時(shí)候, 需要充分考慮功能分子的活性基團(tuán)、空間位阻、合成效率、分子功能等, 所以選擇適合的合成方法可以使多肽修飾事半功倍. 本文將通過(guò)對(duì)目前現(xiàn)有自組裝多肽, 尤其是以FF二肽組裝核心的多肽的修飾進(jìn)行總結(jié), 為之后的研究提供方法和思路.
自組裝多肽的功能化修飾位點(diǎn)主要包括主鏈氨基和羧基, 以及側(cè)鏈的氨基[12]、羧基[13]、羥基[14]和巰基[15]等. 如圖1所示, 修飾方式主要分為兩種: 一是直接修飾, 即功能分子與多肽直接共價(jià)偶聯(lián), 或是將活性基團(tuán)活化以后將分子直接與多肽共價(jià)偶聯(lián). 此方法中的功能分子主要包括: (1)藥物分子, 將藥物分子直接修飾在多肽上, 實(shí)現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)遞送和疾病的治療; (2)探針?lè)肿? 利用自組裝多肽的AIR效應(yīng), 實(shí)現(xiàn)探針在病灶部位的高效富集, 增強(qiáng)成像的信噪比; (3)烷基鏈, 利用烷基鏈調(diào)節(jié)親疏水平衡, 增強(qiáng)組裝能力; (4)聚合物, 聚合物位阻大, 阻礙多肽組裝, 但在特定的策略中需要聚合物的特性; (5)糖, 糖在生物體內(nèi)參與多種生理活動(dòng), 糖肽自組裝體能夠通過(guò)多價(jià)配位效應(yīng)、酶剪切等方式參與生理活動(dòng); (6)其他分子, 除了上述類型, 還有很多其他對(duì)多肽組裝有價(jià)值的小分子. 我們將擇其中應(yīng)用較為普遍的進(jìn)行討論. 二是間接修飾, 即利用連接單元將功能分子與多肽連接. 一些分子有較大的空間位阻, 或者由于自身沒(méi)有可以高效與多肽進(jìn)行連接的活性基團(tuán), 需要引入其它分子作為連接單元。
1 直接修飾
1.1 藥物分子修飾
利用小分子藥物對(duì)病灶區(qū)域的識(shí)別、治療和其自身的親疏水等特性, 將其與自組裝多肽材料共價(jià)偶連, 能夠延長(zhǎng)藥物滯留, 增強(qiáng)藥效, 降低毒副作用. 為了更方便地將藥物分子連在多肽上, 需要將藥物分子的某些官能團(tuán)進(jìn)行活化[16].
例如苯丁酸氮芥(CRB)又稱瘤可寧, 是一種常用的抗癌藥物. CRB具有的正苯丁酸基, 能夠通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法(SPPS)共價(jià)連接到多肽的N端, 即使用苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)作為偶聯(lián)劑, 將CRB的羧基活化后, 與多肽游離的氨基端反應(yīng)生成酰胺鍵. 2020年, 梁春惠等[17]設(shè)計(jì)了一種新的自組裝短肽CRB-YpYY, 將CRB作為遞送藥物和封端基團(tuán), 通過(guò)酰胺縮合共價(jià)結(jié)合到磷酸化短肽YpYY的氨基端, 替代了常用的萘和芴類封端基團(tuán). CRB-YpYY被腫瘤區(qū)域過(guò)表達(dá)的堿性磷酸酶剪切, 變?yōu)镃RB-YYY, 原位自組裝形成凝膠. 比起游離的CRB分子, 這種凝膠展現(xiàn)出更好的腫瘤抑制效果. 這種利用藥物分子替代常用封端基團(tuán)的方法, 為功能化短肽凝膠因子的設(shè)計(jì)提供了新的思路.
喜樹(shù)堿(CPT)作為抗癌藥物對(duì)腸胃癌、肝癌和頭頸癌具有很好的治療效果. 王浩課題組[18]通過(guò)對(duì)喜樹(shù)堿的羥基進(jìn)行活化, 使其能夠很方便地通過(guò)固相合成共價(jià)結(jié)合到多肽裸露的氨基上. 如圖2所示, 喜樹(shù)堿與對(duì)硝基氯甲酸苯酯(npc)在堿性環(huán)境中反應(yīng)得到CPT-npc, 使喜樹(shù)堿可以更容易地與多肽相連. 喜樹(shù)堿分子上的羥基被硝基氯甲酸苯酯活化后, 進(jìn)一步通過(guò)固相合成接到多肽裸露的氨基端. 將藥物分子修飾在多肽上后, 全長(zhǎng)分子可以形成組裝體, 這種組裝體的親水性更加可控, 并能在特定區(qū)域發(fā)生酶響應(yīng), 釋放藥物, 達(dá)到藥物精準(zhǔn)遞送和緩釋的目的. 2019年, 程冬炳等[18]利用該方法設(shè)計(jì)了CPT-LFPR分子, 分子由喜樹(shù)堿和帶有靶向和剪切序列的自組裝多肽組成. 該分子能夠靶向?qū)嶓w瘤, 進(jìn)入細(xì)胞后分子被剪切, 剩下帶有藥物分子的組裝序列, 自組裝成纖維, 長(zhǎng)期滯留在病灶區(qū)域并持續(xù)釋放游離的藥物分子. 這種方式可以減少抗癌藥物對(duì)人體的副作用, 同時(shí)自組裝多肽的AIR效應(yīng)可以使藥物緩慢釋放, 提高治療效果.
-硝基-2,1,3-苯并氧雜噁二唑(NBD)作為一種環(huán)境敏感的熒光基團(tuán), 在疏水環(huán)境中熒光增強(qiáng), 可以結(jié)合自組裝用于特定區(qū)域成像. 徐兵課題組[19]使用NBD-Cl, 合成了k(NBD)模塊, 即NBD-ɛ-D-賴氨酸, 可直接通過(guò)固相合成共價(jià)結(jié)合到多肽裸露的氨基端. 合成過(guò)程如圖3所示, 先利用Boc基團(tuán)保護(hù)的賴氨酸與NBD的親核取代反應(yīng), 及后續(xù)的去保護(hù)反應(yīng)獲得中間體k(NBD), 再通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行多肽修飾.
2019年, 徐兵和王懷民等[19]使用該方法, 將NBD修飾到多肽上, 設(shè)計(jì)了一種和胸腺嘧啶共價(jià)結(jié)合的肽衍生物D-2, 其包含可以促進(jìn)組裝的苯丙氨酸序列FF和能夠與三磷酸腺苷特異性結(jié)合的天冬氨酸氨基酸序列KKFKLKL. D-2能通過(guò)自組裝形成寡聚體, 與RNA結(jié)合后進(jìn)一步組裝形成復(fù)合物, 纖維中的胸腺嘧啶引發(fā)DNA復(fù)制過(guò)程中的DNA損傷, 從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 整個(gè)過(guò)程可以通過(guò)觀察NBD的熒光來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè). 同年, 梁春惠等[20]使用相同合成條件和步驟, 得到了NBD-β-丙氨酸, 設(shè)計(jì)了一種細(xì)胞攝取和核積累增強(qiáng)的自組裝多肽分子Comp. 2. 分子由三部分構(gòu)成: NBD-β-丙氨酸、磷酸化多肽序列FFpYG和抗腫瘤多肽序列TSFAEYWNLLSP. Comp. 2在ALP酶切后自組裝形成凝膠, 能夠發(fā)揮持續(xù)的抗腫瘤效果.
1.2.1 近紅外熒光探針
由于細(xì)胞與組織的自發(fā)熒光在近紅外區(qū)域最小, 使用近紅外探針進(jìn)行成像, 能夠顯著提升組織穿透能力, 提供更高的特異性和靈敏度. 王浩課題組[21]合成了一種氯取代的近紅外菁類染料Cy-Cl, 合成方法如圖4所示, Cy-Cl能夠與多肽的側(cè)鏈巰基在pH=7.5的Tris-Cl緩沖液中, 發(fā)生親核取代反應(yīng), 經(jīng)純化后得到Cy修飾的自組裝多肽, 并實(shí)現(xiàn)對(duì)多種疾病的檢測(cè). 2019年, 趙小小等[22]基于此合成方法, 設(shè)計(jì)了一種原位自組裝熒光探針, 用于對(duì)微小腫瘤的檢測(cè). 分子通過(guò)血液到達(dá)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞時(shí), 被細(xì)胞過(guò)表達(dá)的成纖維細(xì)胞活化蛋白α (FAP-α)剪切, 觸發(fā)原位自組裝, 實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的高效富集, 增強(qiáng)了探針的靈敏度和成像能力, 對(duì)于2 mm的微小腫瘤也有良好的成像效果.
2020年, 安紅維等[23]利用Cy-Cl分子設(shè)計(jì)了一種原位自組裝近紅外多肽探針, 用于腎癌腫瘤的成像. 探針?lè)肿影ㄈ齻�(gè)模塊: (1) RGD肽段, 用于靶向腎癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)的αvβ3整合素; (2) PLGYLG肽段, 能夠被腫瘤區(qū)域過(guò)表達(dá)的金屬基質(zhì)蛋白酶2/9 (MMP-2/9)剪切; (3) Cy修飾的YLGFFC肽段, 也是酶剪切后的殘基, 可以組裝形成具有β-片層結(jié)構(gòu)的納米纖維. 利用組裝體的腫瘤特異性排泄延遲(TER)效應(yīng), 實(shí)現(xiàn)了對(duì)腎癌腫瘤的高靈敏度成像. 相比于傳統(tǒng)探針, 使用該探針進(jìn)行腎癌實(shí)體瘤切除的術(shù)中導(dǎo)航有利于腫瘤的完全切除, 并減少術(shù)后復(fù)發(fā).
1.2.2 聚集誘導(dǎo)發(fā)光類(AIE)熒光探針
具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-induced emission, AIE)特性的探針?lè)肿咏晔艿綇V泛關(guān)注, 與通常熒光分子聚集以后熒光容易淬滅相反, 此類探針?lè)肿釉谌芤褐袔缀醪话l(fā)光, 但聚集狀態(tài)下呈現(xiàn)發(fā)光增強(qiáng)的現(xiàn)象[24]. 基于這種特性, AIE單元與自組裝多肽結(jié)合能夠得到性能優(yōu)越的熒光探針. 首先, AIE類分子通常具有大共軛體系, 其強(qiáng)疏水性提供了組裝驅(qū)動(dòng)力, 分子間π-π相互作用能夠穩(wěn)定組裝體, 這強(qiáng)化了多肽探針的組裝能力. 其次, AIE現(xiàn)象增強(qiáng)了組裝體與游離分子熒光的對(duì)比度, 能顯著提升信噪比, 而多肽的組裝恰好可以促進(jìn)AIE分子聚集. 因此相比于其他的熒光探針修飾, AIE類熒光團(tuán)修飾的自組裝多肽在成像診斷等醫(yī)療應(yīng)用方面有顯著優(yōu)勢(shì)[25⇓-27].
王浩課題組[28]首次合成了一種雙芘分子(BP), 具有AIE性質(zhì), 此分子具有雙芘結(jié)構(gòu), 可形成J型納米聚集物. BP的合成過(guò)程如圖5所示, 在三氯化鋁存在下, 通過(guò)Friedel-Crafts�；磻�(yīng)將芘和烷基(芳基)二氯合成了BP, 再對(duì)其進(jìn)行羧基衍生, 得到的產(chǎn)物能夠通過(guò)固相合成與多肽游離氨基通過(guò)酰胺鍵共價(jià)連接. 2016年, 楊培培等[29]報(bào)道了一種可以形成超分子結(jié)構(gòu)的分子BKP, 第一次將BP用于自組裝多肽材料. BKP分子由BP分子、KLVFF組裝多肽序列和聚乙二醇(PEG)三部分組成, 其中BP分子的疏水性質(zhì)和π-π堆積有利于整個(gè)多肽分子的組裝, 而PEG鏈可平衡整個(gè)分子的親疏水性質(zhì). 該工作研究了PEG鏈的長(zhǎng)度對(duì)自組裝過(guò)程以及最終組裝產(chǎn)物形態(tài)的影響.
2017年, 楊培培等[30]報(bào)道了一種能用于腫瘤部位構(gòu)建巢狀主體的自組裝多肽分子BP-KLVFF-His6-PEG, 該分子的設(shè)計(jì)與前面的工作相似, 不同于加入His6模塊, 這個(gè)模塊由六個(gè)組氨酸組成, 它的側(cè)基帶正電, 在腫瘤微酸性的環(huán)境下發(fā)生質(zhì)子化, 疏水性增強(qiáng), 促使組裝發(fā)生. 分子注射進(jìn)入荷瘤小鼠體內(nèi), 能夠在腫瘤微酸環(huán)境下響應(yīng)觸發(fā)組裝, 最終形成纖維結(jié)構(gòu). 有趣的是, 組裝體能夠捕獲游離的尼羅紅(NR)、吲哚菁綠(ICG)和阿霉素(DOX)等小分子, 作為客體嵌入β-片層, 使得腫瘤部位的熒光強(qiáng)度提升到7.5倍. 2020年, 樊禹等[31]利用類似的策略, BP修飾的多肽自組裝納米材料還被用于模擬人體防御素-6、層粘連蛋白和血小板, 并用于病灶區(qū)域的成像.
1.3 脂肪鏈修飾
脂肪鏈?zhǔn)墙Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的疏水性單元, 可以用于調(diào)控自組裝多肽的親疏水平衡, 修飾后的多肽能形成更加可控的組裝體. 脂肪鏈修飾非常簡(jiǎn)單方便, 通常使用固相合成就能很方便地將脂肪酸偶聯(lián)到多肽上[32-33]. 2013年, Sur等[34]設(shè)計(jì)了一種能夠影響神經(jīng)元分化和成熟的細(xì)胞外基質(zhì), 這種細(xì)胞外基質(zhì)實(shí)際上是由一種肽兩親體PA組裝形成的纖維組成的. PA由十六烷基和一段親水多肽KKKGKDD組成. 在水環(huán)境中, 十六烷基更傾向于聚集在內(nèi)部形成疏水區(qū)域, 親水多肽會(huì)裸露在外, 由于多肽序列中含有帶電氨基酸, 疏水內(nèi)核與靜電相互作用使得分子組裝成β-片層結(jié)構(gòu), 組裝成規(guī)整的纖維. 研究中使用PA組裝成的基質(zhì), 實(shí)現(xiàn)了對(duì)海馬神經(jīng)元在發(fā)育的調(diào)控. 2019年, Sato等[35]利用烷基化修飾的D、L型V3A3K3組裝肽, 研究了多肽的手性對(duì)細(xì)胞毒性和細(xì)胞膜結(jié)合能力的影響.
同時(shí), 對(duì)多肽進(jìn)行類脂質(zhì)修飾, 能夠增強(qiáng)組裝體成顆粒能力, 用于藥物遞送. 2020年, 徐兵課題組[36]設(shè)計(jì)了一種肽-脂質(zhì)綴合物Flag-(C16)2, 這個(gè)分子由肽段DYKDDDDK和類脂質(zhì)部分NH2-Gly-(C16)2連接合成, 在體外組裝成膠束, 中間包載了一種抗生素氯霉素. NH2-Gly-(C16)2的合成如圖6所示, 物質(zhì)的量比為1∶1的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)的甘氨酸(Gly)反應(yīng), 活化Gly的羧基, 十六烷基胺的氨基與氨基酸上的羧基反應(yīng), 得到NH2-Gly-(C16)2, 再通過(guò)相同的方式將NH2-Gly-(C16)2與多肽相連. 當(dāng)分子包載藥物進(jìn)入體內(nèi), 親水多肽序列可以被癌細(xì)胞線粒體上的酶剪切, 類脂質(zhì)體則與線粒體膜融合, 使藥物進(jìn)入線粒體, 從而達(dá)到對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用. 由于烷基鏈的加入使多肽分子可以形成類脂質(zhì)體的納米組裝體, 這種分子設(shè)計(jì)也可用于藥物包載和遞送, 當(dāng)遞送至特定部位, 酶的作用可以使組裝體的形貌發(fā)生改變, 釋放藥物.
修飾烷基鏈有時(shí)不止是用來(lái)調(diào)節(jié)親疏水平衡, 還可以有其他應(yīng)用. 2018年, 張義銘等[37]設(shè)計(jì)了一種二乙炔(DA)修飾肽DA-EGGGGH, 用于金屬離子的裸眼檢測(cè). 分子中多肽序列部分的EGG可以增加多肽端頭的親水性, GGH則用于與鋅和銅離子配位, 觸發(fā)組裝. 10,12-二十五碳二炔酸被修飾在多肽的氨基端, 使分子含有二炔單元, 當(dāng)分子組裝以后, 通過(guò)紫外線照射, 二炔之間發(fā)生聚合反應(yīng), 產(chǎn)生藍(lán)色的聚乙二炔. 由于該分子只有在金屬離子存在時(shí)才能自組裝成為凝膠, 再對(duì)其進(jìn)行紫外照射才能顯示出藍(lán)色, 這種特性可以用于金屬離子快速、靈敏的裸眼檢測(cè).
1.4 聚合物修飾
聚乙二醇(PEG)是一種低毒、低免疫源性的化合物, 是兩親性組裝分子的常用修飾單元, 能夠增強(qiáng)被修飾分子親水端親水能力, 減少材料遞送損失, 延長(zhǎng)分子在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間, PEG-NHS能夠方便地通過(guò)固相合成偶聯(lián)到多肽上, 得到PEG化多肽[38]. 2017年, 喬增瑩等[39]設(shè)計(jì)了一種腫瘤部位響應(yīng)產(chǎn)生毒性的自組裝肽-聚合物偶聯(lián)物P—S—H, 包括一個(gè)疏水的聚合物骨架(P), PEG修飾的金屬基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-2)響應(yīng)片段GPLGIAGQC (S)和pH響應(yīng)肽HLAH (H). 在體外中性環(huán)境下P—S—H以P為疏水核, S為核殼, 形成納米顆粒, 進(jìn)入體內(nèi)后在腫瘤的微酸環(huán)境(pH≤6.5)和過(guò)表達(dá)的MMP-2作用下, HLAH肽對(duì)酸性環(huán)境的響應(yīng)及酶切序列對(duì)MMP-2的響應(yīng), 導(dǎo)致PEG保護(hù)層脫落. 最終形成氫離子包裹的帶正電的納米粒子, 這種粒子能夠有效地內(nèi)化到細(xì)胞中, 并破壞線粒體, 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.
同年, 喬圣林等[40]報(bào)道了一種內(nèi)源性刺激誘導(dǎo)聚合(eSIA)策略. 研究中使用的溫敏聚合物其相轉(zhuǎn)變?cè)?7 ℃以下, 并且每個(gè)單元的支鏈末端都有一個(gè)炔基, 可以與酶相應(yīng)多肽側(cè)鏈的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng). 聚合物與1.3 equiv.的多肽和2.1 equiv.的三乙胺在二甲基亞砜中反應(yīng), 37 ℃下攪拌反應(yīng)12 h, 透析袋純化以后得到產(chǎn)物. 多肽修飾得到新聚合物的相轉(zhuǎn)變溫度在37 ℃以上, 當(dāng)在生物體內(nèi)遇到內(nèi)源性的酶, 多肽被剪切脫離聚合物骨架, 相轉(zhuǎn)變溫度重新回到37 ℃以下, 生物體的體溫使聚合物組裝成納米顆粒. 這種策略十分巧妙, 可以用于腫瘤成像.
1.5 糖基修飾
糖在人體內(nèi)參與多種生命活動(dòng), 例如甘露糖可以靶向巨噬細(xì)胞, 同時(shí)糖上的羥基大大提高了整個(gè)分子的親水性. 所以通過(guò)化學(xué)修飾, 將糖基偶聯(lián)到多肽上可以進(jìn)行多種應(yīng)用[41-42]. 楊志謀課題組[43]利用化學(xué)方法合成了糖酪氨酸Fmoc-Tyr-[β-D-Glc(OAc)4]-OPfp, 作為氨基酸模塊用于固相合成制備糖肽. 合成方法如圖7所示, 首先用五氟苯酚對(duì)Fmoc-Tyr-OH的羧基進(jìn)行保護(hù), 得到Fmoc-Tyr-OPfp. 保護(hù)后的氨基酸可以直接與β-D-半乳糖五乙酸酯反應(yīng), 酪氨酸側(cè)基上的羥基與糖上的乙�；l(fā)生反應(yīng), 得到糖修飾的氨基酸. 終產(chǎn)物使用固相合成法偶聯(lián)到多肽上, 在固相合成結(jié)束后脫除糖上乙�；Ｗo(hù)及五氟苯酚保護(hù)基, 最終通過(guò)固相合成將糖氨基酸連接到多肽上. 這種糖肽的糖苷鍵可以被酶剪切, 剪切后分子親疏水發(fā)生改變, 多肽剪切殘基能夠形成納米組裝體.
2019年, 徐騰焱等[43]使用該方法設(shè)計(jì)并合成了一種能在衰老細(xì)胞選擇性組裝形成凝膠的酶響應(yīng)糖肽衍生物, 其能夠在衰老細(xì)胞處受到過(guò)表達(dá)的β-半乳糖苷酶(β-Gal)剪切, 自組裝性成凝膠. 凝膠進(jìn)一步誘導(dǎo)衰老細(xì)胞細(xì)胞凋亡, 起到清除衰老細(xì)胞的作用.
1.6 其他小分子
除了上述分子, 其他小分子單元的引入也會(huì)對(duì)自組裝多肽產(chǎn)生很大影響, 我們對(duì)于其中常見(jiàn)的、應(yīng)用較為廣泛的單元進(jìn)行總結(jié)如下.
1.6.1 磷酸修飾
堿性磷酸酶(ALP)具有脫磷酸作用, 在多種癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá), 被廣泛用于控制兩親性肽的自組裝. 磷酸分子基團(tuán)體積小, 但有極強(qiáng)的親水性, 多肽中引入磷酸基團(tuán)會(huì)導(dǎo)致分子整體親水性增加. 徐冰課題組[44]設(shè)計(jì)了一種合成磷酸化氨基酸的方法. 合成方法如圖8所示, 酪氨酸與P2O5和磷酸的作用下反應(yīng), 得到磷酸化的酪氨酸, 磷酸酪氨酸的氨基與芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺(Fmoc-OSu)在水相中反應(yīng), 對(duì)氨基酸的氨基進(jìn)行保護(hù), 最終得到Fmoc保護(hù)的磷酸酪氨酸. 通過(guò)固相合成法, 能夠方便地將其作為氨基酸模塊結(jié)合到多肽上, 得到磷酸修飾肽[44]. 在堿性磷酸酶的作用下, 磷酸基團(tuán)從分子上脫落, 分子的親疏水發(fā)生改變, 促使剪切殘基形成組裝體并聚集在細(xì)胞表面, 發(fā)揮相應(yīng)的生物功能.
2018年, 戰(zhàn)捷等[45]設(shè)計(jì)了一種肝癌細(xì)胞特異性攝取的自組裝材料NBD-GFFpY-ss-ERGD, 這種分子分為三個(gè)模塊: 熒光分子NBD作為探針基團(tuán), 磷酸化肽段GFFpY可以被肝癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的ALP剪切后組裝成納米顆粒, ERGD靶向肽模塊通過(guò)二硫鍵與組裝序列連接, 當(dāng)納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞, 胞內(nèi)過(guò)表達(dá)的谷胱甘肽對(duì)二硫鍵進(jìn)行剪切, 組裝成纖維. 該分子通過(guò)肝癌細(xì)胞的多次識(shí)別, 實(shí)現(xiàn)了肝癌細(xì)胞對(duì)材料的特異性攝取, 為肝癌診斷和治療超分子納米材料的設(shè)計(jì)提供了一個(gè)有用的策略.
2019年, 馮趙騫琦等[46]利用磷酸修飾肽設(shè)計(jì)了一種自組裝分子, 該分子能夠?qū)η傲邢偎嵝粤姿崦?PAP)響應(yīng)抑制性前列腺癌細(xì)胞(CRPC)生長(zhǎng). 在CRPC過(guò)表達(dá)的PAP作用下, 分子能夠通過(guò)脫去磷酸基團(tuán), 觸發(fā)自組裝形成纖維, 抑制CRPC生長(zhǎng). 這個(gè)工作是第一個(gè)利用前列腺癌標(biāo)志物PAP催化多肽自組裝從而選擇性抑制CRPC的例子, 這一策略為CRPC提供了一種潛在的替代療法. 同年, 王宇涵等[47]利用該方法合成了一種化合物NBD-GFFpYG-CCK6, CCK-6能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞, 經(jīng)由腫瘤部位過(guò)表達(dá)的ALP剪切, 觸發(fā)自組裝性成凝膠, 從而有效抑制了腫瘤細(xì)胞增殖.
2020年, Yang等[48]將富含色氨酸的短肽磷酸化, 設(shè)計(jì)了一種溶酶體累積分子. 富含色氨酸的多肽易于溶酶體累積, 相比于富含苯丙氨酸的疏水性多肽, 該分子細(xì)胞毒性較低. 這為利用色氨酸替換強(qiáng)疏水氨基酸進(jìn)行自組裝多肽研究提供了依據(jù). 同年, 徐兵課題組[49]設(shè)計(jì)了一種能夠遞送藥物硼替佐米(BTZ)的載體分子, 該分子可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性性釋放磷酸化載體, 分子的組成包括兩部分: (1) AVPI肽段, 能夠選擇性靶向凋亡蛋白抑制劑(IAPs), 進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡; (2) Nap-pYFF, 通過(guò)ALP響應(yīng)觸發(fā)組裝. 載體分子與BTZ體外組裝形成膠束顆粒, BTZ包裹在疏水核內(nèi)部, 膠束表面的磷酸基團(tuán)能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的ALP顆粒, 通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部, 酶剪切后的顆粒形貌轉(zhuǎn)變形成纖維, 釋放BTZ, 同時(shí)纖維表面的AVPI與癌細(xì)胞中的IAPs結(jié)合, 促使癌細(xì)胞凋亡. 有趣的是, 這種遞送方式大大降低了BTZ對(duì)正常細(xì)胞的毒性, 為低毒的藥物遞送提供了一種新方式.
1.6.2 萘基團(tuán)修飾
含萘單元(Nap)可以作為多肽的封端基團(tuán), 利用萘的π-π相互作用提升短肽的自組裝和成膠能力. 2-萘乙酸能夠直接通過(guò)固相合成方便地偶聯(lián)到多肽上[50⇓-52]. 2017年, 羅子超等[53]設(shè)計(jì)了一種Nap封端的自組裝D肽Nap-GFFY, 它可以組裝形成三維納米纖維網(wǎng)絡(luò), 能截留卵清蛋白(OVA), 發(fā)揮疫苗佐劑的效果. 相比于游離的OVA, 疫苗佐劑大大增強(qiáng)了免疫效果. 同時(shí), 實(shí)驗(yàn)還驗(yàn)證了用生物素、Fmoc或吩噻嗪(PTZ)替代Nap進(jìn)行封端, 將導(dǎo)致疫苗佐劑效果下降. 這一發(fā)現(xiàn)表明, 適當(dāng)?shù)姆枷惴舛思瘓F(tuán)對(duì)GFFY的疫苗佐劑效力至關(guān)重要.
2019年, 商宇娜等[54]設(shè)計(jì)了一種新的肽基超分子蛋白膠(Nap-GFFYK(γE)2-NH2), 此化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合后, 迅速折疊成β-片層結(jié)構(gòu), 與蛋白質(zhì)共同組裝成納米纖維和水凝膠. 這種超分子蛋白膠可以與葡萄糖氧化酶/辣根過(guò)氧化物酶(GOx/HRP)和GOx/細(xì)胞色素c (cyt c)共組裝, 形成納米纖維, 顯著增強(qiáng)串聯(lián)酶反應(yīng)的催化活性, 顯示出該超分子蛋白凝膠在構(gòu)建多種蛋白復(fù)合物以及超分子治療發(fā)展方面的巨大潛力.
2 多肽間接修飾
當(dāng)功能分子單元與多肽連接需要通過(guò)連接基團(tuán)偶聯(lián)時(shí), 這種修飾方式可以稱作間接修飾. 為了實(shí)現(xiàn)某些生物功能或設(shè)計(jì)分子設(shè)計(jì), 需要在多肽上連接不同種類的功能分子. 但由于有些功能分子空間位阻較大, 或者功能分子單元自身沒(méi)有能與多肽反應(yīng)的官能團(tuán)等因素, 需要引入其他分子單元, 一端與多肽連接, 另一端與功能分子單元連接來(lái)達(dá)到目的. 多肽間接修飾的方法眾多, 對(duì)其中較為常見(jiàn)的方法進(jìn)行了介紹.
2.1 通過(guò)炔基和疊氮基團(tuán)修飾
點(diǎn)擊化學(xué)(Click chemistry)是一種簡(jiǎn)單高效的反應(yīng)方式, 其中有代表性的就是疊氮-炔基基團(tuán)之間的Husigen環(huán)加成反應(yīng), 這種方法可以被用在多肽修飾上[55]. 如圖9所示, 王浩課題組[56]通過(guò)固相合成在多肽氨基端上連接己缺酸, 用疊氮乙酸對(duì)小分子進(jìn)行改性, 疊氮修飾的多肽和帶炔基的小分子發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng), 連接處生成一個(gè)三唑, 得到最終產(chǎn)物. 利用這種方法對(duì)多肽進(jìn)行修飾的優(yōu)點(diǎn)在于: 分子利用高、反應(yīng)條件溫和、最終產(chǎn)物在復(fù)雜的生理環(huán)境中仍然保持穩(wěn)定, 且可以根據(jù)分子設(shè)計(jì)對(duì)連接基團(tuán)的碳鏈長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整, 適合難與多肽高效偶聯(lián)的小分子.
2020年, 費(fèi)越等[57]通過(guò)類似的方法將作為一氧化氮供體的呋喃類分子單元與多肽相連, 一氧化氮供體通過(guò)疊氮和炔基基團(tuán)之間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)修飾在多肽上, 這種修飾方法有一定的靈活性, 即疊氮和炔基基團(tuán)修飾的位置可以互換. 同年在盧士兆等[58]的工作中, 也通過(guò)疊氮基團(tuán)和炔基的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng), 將聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)分子四苯乙烯兩端連接多肽序列, 多肽片段中的FF有極強(qiáng)的自組裝能力, 形成組裝體以后, 中間的四苯乙烯聚集并且熒光被點(diǎn)亮. 可以用于胰腺腫瘤的成像.
2015年, 陳國(guó)欽等[59]報(bào)道了一種近紅外熒光開(kāi)啟型探針[DBT-2(EEGK-maleimide)], 這種探針?lè)譃槿糠? (1)分子中部是一個(gè)環(huán)境敏感單元4,7-二(2-噻吩基)-2,1,3-苯并噻二唑(DBT), (2)DBT兩端為親水平衡的多肽序列EEGK, (3)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)作為封端基團(tuán). 通過(guò)固相合成的方法, 將疊氮乙酸連接在多肽上. 馬來(lái)酸酸酐先與丙氨酸連接, 再通過(guò)NHS進(jìn)行修飾, 活化羧基端, 將其連接在賴氨酸的側(cè)鏈氨基上. 最終, 通過(guò)炔基和疊氮基團(tuán)的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行連接, 得到最終產(chǎn)物. 此分子在溶液中熒光很弱, 當(dāng)遇到游離的巰基蛋白后, 分子和蛋白質(zhì)組裝成納米粒子, 形成了疏水區(qū)域, 使DBT的熒光被點(diǎn)亮, 這種方法可以用于檢測(cè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)硫醇. 同樣使用這種方法的還有陳超等[60]的工作, 說(shuō)明此方法有很好的普適性.
生物復(fù)雜環(huán)境下的反應(yīng)和組裝條件較為苛刻,需要化學(xué)反應(yīng)高效和快速, 點(diǎn)擊化學(xué)能夠滿足以上需求. 2019年, 王子琦等[61]提出了識(shí)別-反應(yīng)-聚集(RRA)的級(jí)聯(lián)策略用于腎癌的治療. 分子P1-DBCD由一段有靶向功能的多肽和含有炔基的DBCD單元組成, 當(dāng)其進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)特異性靶向腎癌細(xì)胞. 分子P2-N3是一段含有組裝序列KLVFF的多肽, 其氨基端修飾己炔酸作為連接單元, 側(cè)鏈連接熒光分子Cy. 當(dāng)P1-DBCD靶向在細(xì)胞表面以后, P2-N3到達(dá)腫瘤區(qū)域通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)快速與P1-DBCD結(jié)合成為一個(gè)分子, 擴(kuò)展了疏水單元, 在細(xì)胞表面組裝成纖維使癌細(xì)胞的細(xì)胞膜受到擾動(dòng), 從而使得癌細(xì)胞對(duì)化療藥物DOX的敏感性增加. 由此看來(lái), 這種多肽修飾的方法也可以在復(fù)雜生物環(huán)境中發(fā)生, 為自組裝多肽的應(yīng)用提供了新思路.
2.2 通過(guò)酸酐修飾
一些分子上存在羥基、氨基等能與羧基反應(yīng)的基團(tuán)時(shí), 可以選擇使用環(huán)狀酸酐作為連接單元對(duì)多肽進(jìn)行修飾. 在一定條件下, 羥基進(jìn)攻酸酐的羰基碳, 發(fā)生開(kāi)環(huán)的親核取代反應(yīng)生成酯基, 另一端的羧基暴露出來(lái), 可以通過(guò)固相合成與多肽進(jìn)行連接.
姜黃素(Curcumin)是一種酚類抗氧化物質(zhì), 對(duì)肝癌細(xì)胞有明顯的抑制作用, 但其水溶性差, 無(wú)法廣泛應(yīng)用. 2017年, 陳國(guó)欽等[62]合成了一種可以形成水凝膠的多肽衍生物, 用于肝癌的治療. GA-GFFYK(Cur)E-ss- ERGDd的骨架由一段組裝序列GFFYK和親水序列ERGD構(gòu)成, 兩段多肽通過(guò)二硫鍵相連, 多肽氨基端連接了甘草次酸(GA)作為靶頭, 能夠靶向肝癌細(xì)胞. 如圖10所示, 姜黃素先與戊二酸酐反應(yīng), 利用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和琥珀酰亞胺對(duì)產(chǎn)物的羧基進(jìn)行活化, 通過(guò)固相合成與多肽連接. 該分子中的二硫鍵能被癌細(xì)胞中的谷胱甘肽識(shí)別并還原, 二硫鍵斷裂, 殘基組裝成組裝體, 緩慢釋放姜黃素. 2018年, 徐華娥等[63]首次報(bào)道了可以自組裝的多肽類分子Curcumin-FFE-CS-EE, 用于腫瘤治療. 分子由兩段多肽和姜黃素構(gòu)成, 自組裝短肽與親水短肽通過(guò)二硫鍵連接, 姜黃素通過(guò)戊二酸酐與多肽連接(圖10). 此多肽分子可以在谷胱甘肽(GSH)的作用下二硫鍵發(fā)生斷裂, 親疏水被打破以后多肽自組裝形成納米纖維和水凝膠. 這種凝膠作為增敏劑, 與放療聯(lián)合使用顯著降低了大腸癌的腫瘤體積.
2017年, 孫占一等[65]設(shè)計(jì)了能夠組裝成納米顆粒的分子Pam3CSK4-K5. 該分子為兩親性分子, 多肽氨基端和側(cè)鏈連接的三個(gè)烷基鏈作為疏水端, 通過(guò)PEG單元連接寡聚賴氨酸K4和K5作為親水端. 該分子通過(guò)靜電相互作用和疏水作用, 自組裝成納米顆粒. 再與三種免疫刺激劑作用, 形成自組裝納米免疫刺激劑 (SANIs). SANIs可以用于腫瘤的免疫療法, 抑制腫瘤生長(zhǎng).
3 總結(jié)與展望
近年來(lái), 自組裝多肽被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域, 其優(yōu)勢(shì)在于多肽不但可以通過(guò)氫鍵等分子間相互作用進(jìn)行有序排列, 形成規(guī)整可控的組裝體, 還可以通過(guò)生物體的內(nèi)源性因素推動(dòng)其在原位進(jìn)行組裝. 因此, 我們可以把自組裝多肽作為一個(gè)良好的載體, 通過(guò)共價(jià)結(jié)合或者包載的方式與功能分子結(jié)合, 提升藥物和探針等分子的效果.
在需要對(duì)多肽進(jìn)行功能化修飾的時(shí)候, 選擇適合的修飾方法可以使工作事半功倍, 即根據(jù)修飾分子的功能、空間位阻、是否有適合與多肽相連接的官能團(tuán)等條件選擇相應(yīng)的修飾方法. 直接修飾方法的優(yōu)勢(shì)在于合成步驟少, 通�？梢岳霉滔嗪铣煞ㄟM(jìn)行修飾, 大大減少了合成難度; 但部分功能分子缺乏與多肽直接反應(yīng)的基團(tuán), 無(wú)法直接修飾, 或直接修飾反應(yīng)效率和產(chǎn)物純度較低. 相比之下間接修飾反應(yīng)效率高, 反應(yīng)條件溫和, 有著良好的普適性, 適用于難以直接與多肽發(fā)生反應(yīng)或是需要與多肽之間保持一定距離的分子; 然而這種方法需要引入連接單元, 并且產(chǎn)物中功能分子基團(tuán)和多肽之間會(huì)存在較大的距離, 合成步驟也相對(duì)更多.
綜上所述, 根據(jù)功能分子的特點(diǎn)和功能需求選擇恰當(dāng)?shù)男揎椃绞? 是自組裝多肽修飾的關(guān)鍵所在, 也是未來(lái)發(fā)展新的自組裝多肽功能化衍生面臨的挑戰(zhàn). 近年來(lái), 越來(lái)越多的學(xué)者從事自組裝多肽的生物應(yīng)用研究, 這對(duì)自組裝多肽的功能化修飾提出了更高的要求. 因此需要不斷拓展新的自組裝多肽功能化修飾方法, 為自組裝多肽衍生物的合成及應(yīng)用提供新的選擇和方向.
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