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修飾性肽核酸的合成研究進(jìn)展
瀏覽量:566 | 2024/4/14 13:42:10


摘要:肽核酸(PNA)是一類以多肽骨架替代DNA的戊糖磷酸骨架的寡核苷酸類似物,基本的骨架是N-(2-氨基乙基)甘氨酸。肽核酸具有良好的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性,如穩(wěn)定性高\(yùn)雜交特異性強(qiáng)\不被核酸酶和蛋白酶水解等,但其水溶性差,細(xì)胞膜通透性低。筆者從骨架\堿基\骨架和堿基的連接方式與位置等方面對(duì)修飾性肽核酸的合成研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,使肽核酸具有更好的應(yīng)用前景。

肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)是一種全新的DNA類似物,首先是由Nielsen等[1]發(fā)表于《science》雜志中的以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架(圖1),合成了肽核酸。PNA不帶負(fù)電荷,與DNA和RNA之間不存在靜電斥力,提高了結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性;另外,它與DNA和RNA雜交表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性和特異序列識(shí)別能力。PNA可以作為分子生物學(xué)和功能基因工具、診斷和檢測(cè)的探針以及生物傳感器等,應(yīng)用前景廣泛[2-3]。


PNA具有優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)以及生物學(xué)性質(zhì),被廣泛地運(yùn)用于疾病的診斷和治療。但它的水溶性較低、細(xì)胞膜通透性差,為此,人們對(duì)PNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行了修飾和改造,以期有更好的應(yīng)用前景。筆者對(duì)近十年來修飾性PNA的合成進(jìn)展進(jìn)行綜述。


1 aeg pNA


aegPNA(N-2-aminoethylglycine peptide nucleic acid)的基本骨架是N-(2-氨基乙基)甘氨酸,單體的合成主要包括骨架的合成、堿基的保護(hù)以及將堿基連接到骨架未受保護(hù)的氮上(圖2)。


骨架的合成方法主要有3種[4]:①以乙二胺或乙腈為原料,與鹵代乙酸衍生物進(jìn)行烷基化反應(yīng)(圖3a);②還原希夫堿反應(yīng)(圖3B);③采用氨基乙醇與保護(hù)的甘氨酸甲酯進(jìn)行MitsunoBu反應(yīng)(圖3c)。

4種堿基中胸腺嘧啶不需要進(jìn)行保護(hù),直接與鹵代乙酸酯進(jìn)行烷基化反應(yīng),再經(jīng)皂化得到胸腺嘧啶乙酸;胞嘧啶和腺嘌呤因其結(jié)構(gòu)上有活潑的氨基,需要先對(duì)其進(jìn)行保護(hù);鳥嘌呤的保護(hù)過程較為復(fù)雜,常用的方法是以2-氨基-6-氯嘌呤為原料,烷基化反應(yīng)后再將氯水轉(zhuǎn)化為羰基[5](圖4)。將堿基的乙酸衍生物通過酰胺鍵與骨架上未受保護(hù)的氮原子相連,就得到了aeg PNA單體(圖5)。

2 修飾性PNA


目前,研究者主要從骨架、堿基以及堿基與骨架的連接方式和位置3個(gè)方面對(duì)aegPNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造(圖6),修飾后的PNA表現(xiàn)出更好的生物學(xué)和藥動(dòng)學(xué)特性。常見的幾種修飾性PNA單體見表1。


2.1 骨架的修飾
通過對(duì)aegPNA骨架進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,優(yōu)化它的特性,如水溶性、細(xì)胞膜通透性以及結(jié)合穩(wěn)定性和特異性等。


2.1.1 引入手性支鏈的骨架  aeg PNA骨架為N-(2-氨基乙基)甘氨酸,眾多研究者分別在α、β、y位引入手性支鏈來改善其缺點(diǎn),使PNA在生物學(xué)、生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有更好的應(yīng)用前景。


α位引入手性支鏈:aeg PNA具有較低的水溶性,與cD-NA/RNA雜交的方向性不強(qiáng)(平行/反平行)。Mitra等[6]在PNA骨架的α位引入氨基亞甲基側(cè)鏈,增加了與cDNA雜交的穩(wěn)定性,并且能夠有效的穿過細(xì)胞膜,對(duì)細(xì)胞的毒性較小(圖7a)。Hamzavi等[7]報(bào)道合成了α碳糖基化的新型PNA單體。由于糖和細(xì)胞表面的相互作用,該修飾獲得的α-PNA骨架增強(qiáng)了選擇生物分布以及細(xì)胞定位特性(圖7B)。Aguado等[8]將環(huán)丁基羰基連接到骨架的α位上,合成了新型的具有光學(xué)活性的PNA,提高其在體內(nèi)的生物利用度,優(yōu)化在細(xì)胞中的定位和傳遞(圖7c)。


y位引入手性支鏈:除了在PNA骨架的α位引入取代基外,越來越多的研究者對(duì)PNA的y位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。與α位相比,y位的修飾更有利于提高PNA與DNA結(jié)合的親和力[9]。Huang等[10]首次報(bào)道合成了y位上含有賴氨酸的PNA單體,并采用手性HPLC分離得到中間體和單體(圖8a)。2009年sahu等在PNA骨架的y位引入胍基(yGPNA),與DNA和RNA雜交具有更高的親和力和序列選擇性,并且容易被哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝取(圖8B);2011年該研究團(tuán)隊(duì)又將二甘醇單元引入到PNA骨架的y位上,與DNA和RNA雜交也表現(xiàn)出很高的親和力和序列選擇性,同時(shí)增加了水溶性[11](圖8c)。Pensato等[12]采用穩(wěn)定的中間體(疊氮和胺)合成了y位上含有巰基甲基PNA單體(圖8d)。

β位引入手性支鏈:PNA骨架的β位對(duì)應(yīng)于DNA中脫氧核糖部分上的C4,,C4,是手性碳原子,因此,在β位引入手性中心可能會(huì)影響PNA與DNA的結(jié)合能力。除了骨架上引入環(huán)狀結(jié)構(gòu)使β碳原子成為手性碳,只在β位引入單一取代基的β-PNA直到2011年才被合成出來[13],其熱變性和圓二色譜研究表明,S構(gòu)型能與DNA形成穩(wěn)定的雜交,為進(jìn)一步合成具有更優(yōu)特性的β-PNA提供基礎(chǔ)(圖9)。

2.1.2   引入環(huán)狀結(jié)構(gòu)的骨架   PNA骨架中不含有離子鍵,與核酸雜交時(shí)表現(xiàn)出較高的親和力和穩(wěn)定性。但中性骨架使PNA水溶性較低,因此使PNA在醫(yī)藥和其他方面的應(yīng)用受到一定程度的限制。氧基肽核酸(OPNA)中含有醚鍵,增強(qiáng)了主鏈的靈活性,使其水溶性提高,但對(duì)RNA的親和性不高。為了進(jìn)一步優(yōu)化OPNA的結(jié)構(gòu),kitamatsu等將吡咯烷基引入到骨架中形成了吡咯烷氧基肽核酸(POPNA)(圖10a)。在此基礎(chǔ)上,該研究團(tuán)隊(duì)合成了主鏈中含有叔胺基團(tuán)的新型肽核酸(PAPNA),它能夠控制雜交過程中的穩(wěn)定性[14](圖10B)。Ngamwiriyawong等[15]采用新的還原烷基化反應(yīng)合成了氨基乙基脯氨酰肽核酸(aepPNA),實(shí)驗(yàn)研究表明,立體構(gòu)象為順式的5-乙基尿嘧啶aepPNA能與RNA形成穩(wěn)定的三螺旋(圖10c)。


其他帶環(huán)狀結(jié)構(gòu)的PNA單體見圖10d、10e[16-17],它們?cè)谛再|(zhì)上都比aegPNA有一定的優(yōu)點(diǎn),如增加細(xì)胞膜的通透性 ,提高結(jié)合親和力等。


2.2  堿基的修飾
除了對(duì)PNA骨架進(jìn)行修飾外,人們也對(duì)其形成PNA的堿基部分進(jìn)行了改造,以期提高修飾后PNA的生物學(xué)活性,以拓展PNA的應(yīng)用前景和專一性。


2.2.1  DNA的4種堿基    DNA的A、T、C和G4種堿基中,鳥嘌呤乙酸衍生物的合成較為復(fù)雜,對(duì)其進(jìn)行修飾具有一定的挑戰(zhàn)性,人們主要研究的對(duì)象是其他3種堿基的修飾。suchy等[18]采用還原鎳介導(dǎo)的環(huán)化反應(yīng),在胞嘧啶環(huán)上引入另一環(huán)狀結(jié)構(gòu)(5,6-BenzopC),使PNA與DNA和RNA雜交時(shí)具有很強(qiáng)的序列穩(wěn)定性,并且本身具有熒光特性,不需要單獨(dú)熒光標(biāo)記(圖11a)。Guha等[19]將2-(鄰硝基苯基)-丙基(NPP)引入到腺嘌呤環(huán)中(ANPP),仍然可以通過Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)的形式與DNA或RNA雜交(圖11B)。Merino等合成了3-(氨甲基)-2-(羧甲基)異惡唑烷基胸腺嘧啶[(3-aminomethyl)-2-(carBoxymethyl)isoxazolidinylthymine,amcmiT](圖11c)。Wojciechowski等對(duì)胞嘧啶環(huán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,合成了PhpC(6-phenylpyrrolocytosine),該P(yáng)NA單體與DNA或RNA雜交時(shí)增強(qiáng)了結(jié)合親和力。此外,WatanaBe等[20]在胞嘧啶環(huán)的4-位氨基上引入(6-溴-7-甲氧基香豆素)-4-甲氧基羰基,提高了PNA的光化學(xué)特性。


2.2.2尿嘧啶  除了DNA的4種堿基外,還有一些天然存在的核酸堿基,如尿嘧啶、肌苷等。Matarazzo等[21]合成了5-(吖啶-9-氨基)尿嘧啶,與DNA復(fù)合物熱變性研究表明,該低聚物能區(qū)分出完全匹配的互補(bǔ)鏈及U-G,U-C,U-T不匹配鏈。該堿基的修飾為PNA中引入其他化學(xué)修飾堿基提供了一條新途徑(圖12a)。Gasser等[22]對(duì)尿嘧啶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,合成了5-(二茂鐵基甲基氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮,它能夠檢測(cè)DNA鏈的單堿基錯(cuò)配以及尿素衍生物、巴比妥等中性分子(圖12B)。

2.2.3堿基類似物  近年來,隨著人們對(duì)PNA的不斷研究,許多的堿基替代物被合成出來,它們都能和DNA雜交。vilaivan等[23]以次黃嘌呤作為堿基,合成了次黃嘌呤 acpcP-NA[D-prolyl-(1s,2s)-2-aminocyclopentanecarBoxylic acid],它在與DNA雜交過程中能代替G與C互補(bǔ)配對(duì),從而解決了GPNA合成困難、容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)等缺點(diǎn)(圖13a)。Moustafa等[24]以4-(4-二甲氨基苯基)偶氮苯為堿基替代物,該偶氮苯PNA單體能與核酸形成穩(wěn)定雜交,并且熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)100倍(圖13B)。Imoto等[25]以2-氨基-6-乙烯基嘌呤作為堿基替代物,將其連接到PNA骨架中,期望成為新的生物學(xué)工具調(diào)控基因表達(dá)(圖13c)。

2.3  堿基與骨架的連接
PNA中堿基一般通過乙酰基與骨架結(jié)合。改變堿基與骨架的連接方式和位置,使PNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化,可能會(huì)影響雜交的穩(wěn)定性。


2.3.1 連接方式   aeg PNA單體通常是先將堿基形成堿基乙酸,再通過縮合方式連接到骨架上的未受保護(hù)的N原子上。然而,zengeya等[26]先將骨架上未受保護(hù)的N與氯乙酸反應(yīng)形成酰氯,再直接與堿基反應(yīng)(圖14a)。Buchardt等[27]用丙;娲阴;鶎⑿叵汆奏みB接到PNA骨架中(圖14B)。zarra等[28]用乙基替代乙;B接,并且在骨架中引入羧酸酯,增強(qiáng)PNA的水溶性(圖14c)。


2.3.2  連接位置   除了改變連接方式外,堿基還可以通過改變連接位置與骨架結(jié)合。Huang等[29]采用U-4CR法合成了新型的PNA單體,將其堿基連接到骨架的α位上(圖15a)。kitamatsu等[30]通過環(huán)狀結(jié)構(gòu)將堿基與PNA骨架進(jìn)行連接(圖15B)。

3  展望


通過對(duì)骨架、堿基以及骨架和堿基連接方式與位置的改造,大量修飾的PNA已經(jīng)被合成出來。這些新型的PNA明顯改善了水溶性、提高雜交親和力等,實(shí)現(xiàn)了研究者的PNA藥學(xué)功能和目的。目前,修飾后的PNA作為分子生物學(xué)工具在基因診斷與檢測(cè)、基因芯片和生物傳感器等方面的應(yīng)用已經(jīng)逐步成熟;但是,作為反義藥物和反義試劑,用于疾病的診斷和治療中仍然受到一定限制。主要原因是PNA細(xì)胞攝取率低、細(xì)胞內(nèi)靶向性差等。因此,為滿足實(shí)際臨床應(yīng)用的需要,今后PNA結(jié)構(gòu)修飾的重點(diǎn),其一應(yīng)該是加強(qiáng)對(duì)改善細(xì)胞膜通透性功能的結(jié)構(gòu)修飾研究;其二,實(shí)現(xiàn)PNA在細(xì)胞內(nèi)的準(zhǔn)確定位仍需要進(jìn)一步的研究;其三,PNA是抗病毒新藥,針對(duì)具有抗特異性病毒的修飾太少,真正可實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的修飾性PNA還需要不斷地研究。


修飾性PNA主要還是以甘氨酸為骨架,用其他氨基酸代替甘氨酸骨架,對(duì)PNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的修飾和改造,進(jìn)一步研究其新陳代謝途徑、藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特性,不斷完善它的物理化學(xué)及生物學(xué)特性,以滿足PNA真正成為藥物運(yùn)用于臨床的需要,仍然是今后研究的重點(diǎn)。


免責(zé)聲明:本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí),版權(quán)歸原作者及原雜志所有,如有侵權(quán),可聯(lián)系刪除。文章標(biāo)注有作者及文章出處,如需閱讀原文及參考文獻(xiàn),可閱讀中國(guó)藥學(xué)雜志2015年11月第50卷第22期。

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