摘要：多肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體作為藥物或核酸的載體可以主動靶向腫瘤部位，使抗腫瘤藥物或核酸在特定區(qū)域釋放，降低藥物對正常組織或細胞的毒副作用、提高藥物／核酸的治療效果。筆者主要從多肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體的釋藥機制、修飾方式和應(yīng)用等方面進行綜述，為多肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體的制備及抗腫瘤藥物載體設(shè)計方面的研究提供相應(yīng)參考。
脂質(zhì)體最初由Bangham等[1] 觀察磷脂在水中的分散性狀時發(fā)現(xiàn)，由于其疏水親水作用，磷脂疏水端向內(nèi)部聚集，而親水端的氫鍵和水相鍵合暴露在外，形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的閉合囊泡。脂質(zhì)體具有較好的生物相容性，無毒、無溶血性、無免疫原性，可生物降解，因此成為目前最常用的載體并在藥物傳輸方面發(fā)揮了重要的作用[2]。脂質(zhì)體表面易被修飾，可以包載各類藥物分子或核酸分子[3-4]。傳統(tǒng)脂質(zhì)體的磷脂成分與細胞膜成分高度相似，具有被動靶向性，易集中于機體的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，缺乏特定的組織靶向性，導(dǎo)致相應(yīng)的治療性核酸和疏水性藥物的利用率較低。近幾年，國內(nèi)外研究者陸續(xù)制備出pH敏感脂質(zhì)體[5]、熱敏感脂質(zhì)體[6]、超聲波敏感脂質(zhì)體[7]和光敏感脂質(zhì)體[8]等各種功能性脂質(zhì)體用于藥物／核酸的高效傳遞。
腫瘤細胞具有旺盛的糖酵解能力，缺氧及有氧條件下都能產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，加上質(zhì)子泵(H+-ATPase)及來自磷酸戊糖途徑的CO2作用，導(dǎo)致腫瘤組織局部微環(huán)境pH值(5.8~7.0)低于正常組織(7.4)[9]。利用腫瘤組織局部微環(huán)境的這種特性，pH敏感脂質(zhì)體在微酸環(huán)境下產(chǎn)生一定的結(jié)構(gòu) 變化，從而作用于腫瘤組織并釋放藥物。其中，多肽修飾的 pH敏感脂質(zhì)體，可利用各種功能性多肽的酸敏感、靶向及穿 膜作用[10-11] ,增強脂質(zhì)體的pH敏感性、提高pH敏感脂質(zhì)體 對腫瘤組織的靶向結(jié)合能力，形成多響應(yīng)性或多功能性脂質(zhì) 體，介導(dǎo)脂質(zhì)體在腫瘤環(huán)境下釋放藥物，顯著提高藥物的生物 利用率并降低其毒副作用。因此，近年來多肽修飾的pH敏感 脂質(zhì)體成為藥物傳遞系統(tǒng)的研究熱點。筆者主要從多肽修飾 的pH敏感脂質(zhì)體的釋藥機制、修飾方式和應(yīng)用等方面進行綜 述，以期對pH敏感脂質(zhì)體藥物／核酸傳遞系統(tǒng)的研究提供參考。
1 多肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體的組成及釋藥機制
筆者綜述的脂質(zhì)體pH敏感性主要有3種形式體現(xiàn)：①制備基礎(chǔ)脂質(zhì)體的材料，例如具有pH敏感性的磷脂或膽固醇；②pH敏感性多肽；③其他具有pH敏感性的鍵或材料。
早期制備pH敏感脂質(zhì)體的材料主要由兩親性的二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE)和陰離子脂類，如膽固醇琥珀酸單酯(cholesterylhemisuccinate,CHEMS)及油酸等材料通過調(diào)節(jié)其比例合成[12]。在生理pH值(7.4)條件下，DOPE和CHEMS可以形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體雙分子層。在腫瘤組織微環(huán)境pH值(5.8~7.0)或者溶酶體pH值(4.5~5.0)的條件下，質(zhì)子化的DOPE和CHEMS導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層的結(jié)構(gòu)由緊密轉(zhuǎn)變成疏松，內(nèi)部的藥物或核酸得到釋放[13]。類似的，一些含有脂-聚合物的復(fù)合結(jié)構(gòu)，同樣可以制備出pH敏感性脂質(zhì)體[14]。早期的這些脂質(zhì)體靶向性較差，脂質(zhì)體進入機體后，容易被非特定細胞內(nèi)吞，在溶酶體的酸性環(huán)境下釋放抗癌藥物，損害正常細胞或組織。
近年來，由于多肽分子的生物多樣性，越來越多具備特 定功能的多肽被不斷發(fā)現(xiàn)和研究，例如結(jié)構(gòu)較為簡單的多聚 組氨酸(poly-histidine)[15] 和多聚賴氨酸(poly-lysine)[16] ,以 及源自流感病毒的INF7肽(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGW- YGC)[17]都具有較強的pH敏感性。其他研究較多的功能性 多肽包括溫度敏感性多肽[18]、多聚陽離子／細胞穿膜肽[19]、腫瘤靶向肽[20-21]等。多肽具有一個顯著的結(jié)構(gòu)性優(yōu)勢，即可 以在不影響原有功能性多肽片段的基礎(chǔ)上，通過固相合成或 生物合成，在多肽的一端或兩端引入新的功能性多肽序列，獲得多功能性融合肽[22]。結(jié)合這些不同功能性的多肽，多 肽修飾的脂質(zhì)體不僅具有pH敏感性，還可以具備多功能性，例如利用受體／配體結(jié)合方式來靶向腫瘤細胞。這種具有受 體／配體結(jié)合能力的pH敏感脂質(zhì)體進入細胞的機制，往往不 同于普通脂質(zhì)體的融合方式。如類似RGD/αVβ3[23] 或者 Transferrin/TfR[24] 的結(jié)合方式，會誘導(dǎo)腫瘤組織細胞主動內(nèi) 吞脂質(zhì)體繼而釋放藥物／核酸，此類多肽修飾的pH敏感脂質(zhì) 體藥物／核酸釋放過程，見圖1。
2 多肽修飾pH敏感脂質(zhì)體的修飾方式
磷脂和膽固醇是合成脂質(zhì)體的主要材料，研究者通過多 肽對磷脂和膽固醇的修飾制備出多種多肽修飾的 pH 敏感脂 質(zhì)體。此外，直接將小分子多肽片段嵌入到脂質(zhì)體內(nèi)，制備 多肽嵌入型 pH 敏感脂質(zhì)體的研究也有報道。
2. 1 多肽修飾磷脂類
多肽主要通過多種化學(xué)鍵合的方式修飾磷脂[25]。例如Zhao等[26]將pH敏感肽[H7K(R2 )2]通過酰胺鍵和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethano-lamine,DSPE)連接，采用薄膜分散法制備出包載多柔比星的pH敏感脂質(zhì)體。同年，Xia等[27] 采用加成反應(yīng)將DSPE-PEG2000-Mal和具有pH響應(yīng)性的細胞穿膜肽TH肽[AGYLL-GHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys]連接，合成了DSPE-PEG2000-TH,然后將大豆磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000-OMe和DSPE-PEG2000-TH按照摩爾比59∶33∶2∶6制備出多肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體。多肽修飾磷脂的主要鍵合方式見圖2。
2. 2 多肽修飾膽固醇類
膽固醇具有調(diào)節(jié)磷脂雙分子層流動性的作用。具有pH敏感性的CHEMS是一種可被質(zhì)子化的膽固醇，在酸性條件下，質(zhì)子化的CHEMS由于靜電斥力作用，造成脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的破壞[28]。研究者將功能性多肽片段和CHEMS通過酰胺鍵連接，制備出各種多肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體。如Chang等[23] 將靶向整合素αvβ3的小分子肽RGD和CHEMS通過酰胺鍵相連，RGD修飾的pH敏感脂質(zhì)體能有效靶向αvβ3過表達的癌細胞，增強多西他賽的藥用效果。其RGD修飾CHEMS的方式及pH敏感脂質(zhì)體的釋藥過程見圖3。
GALA(WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA)是一種pH敏感的膜融合肽，其肽鏈在生理pH條件下以無規(guī)卷曲為主，而在酸性條件下，富含谷氨酸的肽鏈質(zhì)子化，GALA的結(jié)構(gòu)則以α螺旋為主[29]。Kakudo等[30]將GALA和氯甲酸膽固醇酯通過酯鍵連接，制備出GALA肽修飾膽固醇的pH敏感脂質(zhì)體。
2. 3 多肽嵌入型
類似于 GALA , 許多 pH 敏感多肽在酸性條件下，會導(dǎo)致 肽鏈二級結(jié)構(gòu)的變化，如果將此類多肽嵌入到磷脂雙分子 層，制備得到的 pH 敏感脂質(zhì)體會隨著 pH 值環(huán)境的變化改 變其雙分子層的穩(wěn)定性，從而釋放抗腫瘤藥物或核酸。
例如，Sosunov 等[31] 及 Yao 等[32] 研究者采用 pH 敏感多 肽 pHLIP ( ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADE GT)嵌入的方式制備了 pH 敏感脂質(zhì)體。Reja 等[33] 設(shè)計了 一系列多肽，它們的疏水氨基酸和極性氨基酸間隔排列，在 二級結(jié)構(gòu)上能形成 pH 敏感的異源二聚體，生理條件下呈現(xiàn) 螺旋結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)體的磷脂雙分子層穩(wěn)定，但是在 pH 5. 5 的環(huán) 境中，多肽質(zhì)子化，其結(jié)構(gòu)由螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成松散的無規(guī)卷 曲，異源二聚體解聚，從而使 pH 敏感脂質(zhì)體內(nèi)的藥物得以釋 放。其中，P3 ( LKKIKDKLEKIKSKLYKIKNELAKIKKL) 與 P5 (LKKIKDKLEKZKSKLYKIKNELAKIKKL) 形成的異源二聚體 pH 敏感性最為突出。
由于這類多肽需要整體嵌入到脂質(zhì)體的疏水層，因此多肽序列中一般含有較多的疏水性氨基酸，例如亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、色氨酸(W)、纈氨酸(V)、丙氨酸(A)等。過多的疏水性氨基酸給脂質(zhì)體的制備帶來一定的困難，因此在多肽嵌入型pH敏感脂質(zhì)體中，使用兩親性雜合肽的方式最為常見。例如，Wang等[34]通過嵌入的方式將辛胺接枝的聚天冬氨酸(PASP-g-C8)插入到脂質(zhì)體中，見圖4。疏水性C8可以將聚合物“錨定”在脂質(zhì)體疏水區(qū)，聚天冬氨酸的游離羧酸基團則可以在酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化而介導(dǎo)構(gòu)象的變化，從而使藥物得到快速釋放。Hama等[35] 將接枝十八烷酸的pH敏感多肽SAPSP(stearyl-GGGGHGAHEHAGHEHAAGEHHA-HE-NH2)嵌入到脂質(zhì)體內(nèi)，提高了脂質(zhì)體對腫瘤微環(huán)境的靶向性。Jiang等[36] 制備的脂質(zhì)體嵌入了十八烷酸接枝的R6H4(stearyl-R6H4),R6H4兼具pH敏感性(H4)及細胞穿膜(R6)的功能，形成了一種多功能性pH敏感脂質(zhì)體。
有意思的是，Su等[37]設(shè)計了2條具有pH敏感性，同時又富含正電荷的多肽序列(AWWKKKGGNNN、AWWRRRG-GNNN),由于具有疏水性AWW,多肽可以“錨定”到脂質(zhì)體的疏水區(qū)，同時富含正電荷的賴氨酸／精氨酸片段又可以與表面帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體通過靜電作用而形成脂質(zhì)體的“外衣”，這既是一種多肽嵌入型，同時也是一種多肽修飾磷脂型的pH敏感脂質(zhì)體。
3 多肽修飾的pH 敏感脂質(zhì)體作為載體的主要應(yīng)用
3. 1 多肽修飾 pH 敏感脂質(zhì)體作為疏水性藥物的載體
為了解決疏水性抗腫瘤藥的生物利用度低和靶向性差 等問題，通常使用物理包埋的方法將藥物包裝到脂質(zhì)體內(nèi)。脂質(zhì)體的磷脂雙分子層具有包裝疏水性藥物的天然優(yōu)勢。腫瘤組織微環(huán)境是弱酸性環(huán)境，pH約為5.8~7.0[9]。因此，pH敏感脂質(zhì)體成為一種重要的抗腫瘤藥物載體，受到越來 越多學(xué)者的關(guān)注。
Ding等[38] 利用酸敏感腙鍵設(shè)計了一種穿膜肽(GGRRRRRRRRR)修飾的pH敏感脂質(zhì)體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH敏感脂質(zhì)體攜載的DiR熒光探針在小鼠的腫瘤部位所發(fā)出的熒光信號明顯高于其他載體的信號，體內(nèi)藥物分布實驗進一步證實，穿膜肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體降低了藥物在其他組織器官的分布。Zhao等[26] 利用具有多臂結(jié)構(gòu)的pH敏感肽[H7K(R2)2]修飾磷脂形成pH敏感脂質(zhì)體包載多柔比星。體外實驗結(jié)果證實，在pH5.5時脂質(zhì)體的釋藥量達到85%,遠遠大于pH7.4時20%的釋藥量，顯示出較強的pH敏感性。體內(nèi)藥物分布實驗也證實，這種pH敏感脂質(zhì)體增加了藥物在腫瘤部位的釋放，對小鼠膠質(zhì)瘤組織具有更強的抑制作用。
Shi等[39]利用環(huán)形的腫瘤靶向小分子肽[c(RGDfK)] 和穿膜TH肽偶聯(lián)，制備pH敏感脂質(zhì)體并包載紫杉醇�；� 體影像學(xué)顯示，pH敏感脂質(zhì)體組治療的荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤 抑制率為85.04%,遠遠高于其他對照組。而Koren等[40] 采用經(jīng)典的穿膜肽TAT、抗癌抗體2C5同時修飾磷脂，制備 了一種結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的pH敏感免疫脂質(zhì)體，并包載多柔比 星。除了pH響應(yīng)性，這種多功能脂質(zhì)體同時還具有良好的 穿膜能力及特異的靶向性。結(jié)果顯示，在pH5.0條件下，MCF-7細胞和HeLa細胞攝入的脂質(zhì)體明顯高于其在pH 7.4時的攝入，同時實現(xiàn)了多柔比星在腫瘤細胞的有效 富集。
此外，除了對脂質(zhì)體的外在結(jié)構(gòu)加以改進，為了應(yīng)對腫瘤的多重耐藥性問題，脂質(zhì)體可包載多種藥物。Liu等[41] 利用Her-2抗體修飾pH敏感脂質(zhì)體，同時包載維拉帕米（異搏定）和多柔比星，有效抑制了Her-2過表達的乳腺癌組織，抑制率提升至83.9%。
3. 2 多肽修飾的 pH 敏感脂質(zhì)體作為核酸傳遞的載體
隨著核酸研究的發(fā)展，例如治療型質(zhì)粒DNA、siRNA、miRNA和snoRNA等多種功能性核酸被發(fā)現(xiàn)具有重要的醫(yī) 用價值。但這些核酸分子，特別是RNA容易被體內(nèi)RNase 降解。利用多肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體對核酸進行包載，可 以提高基因治療的效果。
Hatakeyama等[42]將GALA連到膽固醇上制備出pH敏感脂質(zhì)體，并研究其傳遞siRNA后的基因沉默效果。結(jié)果證實，載入siRNA的pH敏感脂質(zhì)體的體外基因沉默效率與siRNA本身并沒有差別，但在小鼠腫瘤組織中效率提高了40%,說明用GALA肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體可以有效保護核酸并將其靶向傳遞到腫瘤部位。近年來，修飾脂質(zhì)體的多肽序列設(shè)計得更為精妙，功能也愈發(fā)突出。例如，Xiang等[43]設(shè)計了一種新型的pH敏感型細胞穿膜肽(activatablecell-penetratingpeptide,ACPP)。修飾脂質(zhì)體的ACPP由中間的蛋白酶切位點連接兩端的多聚陽離子／穿膜肽R8和多聚陰離子肽(GHE)4,形成脂質(zhì)體-R8-酶切位點-(GHE)4 的結(jié)構(gòu)。在腫瘤組織微環(huán)境的低pH值下，R8和(GHE)4之間由靜電吸引轉(zhuǎn)為排斥。同時，酶切位點被腫瘤組織過表達的MMP2/9切斷，R8序列繼續(xù)保留在脂質(zhì)體上，行使穿膜肽的功能。這一過程最終促進了ACPP修飾的pH敏感脂質(zhì)體在特定的腫瘤組織部位被細胞內(nèi)吞，增強了包裝的siRNA對關(guān)鍵原癌基因Plk1的沉默效果。
目前，構(gòu)建類似雞尾酒療法的pH敏感脂質(zhì)體共傳遞藥物和核酸的研究也在開展。例如，Li等[44]設(shè)計的pH敏感脂質(zhì)體能夠同時包載喜樹堿和siRNA。Yao等[45]制備了能同時包載索拉非尼、siRNA的pH敏感脂質(zhì)體。利用pH敏感多肽H6L9修飾的脂質(zhì)體在“溶酶體逃逸”后，釋放的miRNA和喜樹堿共同作用于癌細胞，通過下調(diào)Hoxd10的表達和對細胞的直接殺傷作用，誘導(dǎo)細胞的凋亡和壞死[46]。
4 結(jié)語與展望
多肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體作為藥物／核酸載體，具有pH敏感性及對腫瘤組織的靶向性等特征，可實現(xiàn)藥物／核酸在腫瘤部位的聚集及快速釋放，減少了抗腫瘤藥物的毒副作用，提高藥物的利用率，具有良好的應(yīng)用前景。多肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體的發(fā)展目前還存在諸多障礙，其穩(wěn)定性及特異性還有待進一步提高。相信隨著研究的深入和制備技術(shù)的成熟，研究者能夠研制出更高效穩(wěn)定的pH敏感脂質(zhì)體應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。
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