摘要 近年來(lái),中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅了人類(lèi)的生命健康,血腦屏障(blood⁃brain barrier,BBB)的存在阻止了大部分藥物進(jìn)入大腦,這使得CNS疾病的治療成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域的重大難題。納米技術(shù)的出現(xiàn)使得藥物具有穿透BBB的潛力,小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)藥物的快速發(fā)展也給CNS疾病患者帶來(lái)了曙光,但是納米載體向腦部遞藥會(huì)遇到許多障礙,作為siRNA納米載體進(jìn)行腦部遞送的條件也非?量獭1疚闹饕C述了脂基納米粒、殼聚糖納米粒、聚乙烯亞胺納米粒、樹(shù)狀大分子納米粒、納米凝膠、納米膠束、納米乳、外泌體、細(xì)胞、siRNA綴合物等作為siRNA腦部遞藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展及優(yōu)缺點(diǎn),以期探尋一種合適的siRNA納米遞送系統(tǒng),用于BBB的穿透。
隨著全球人口日益老年化以及工作壓力等外界因素的增加,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)疾病的發(fā)病率不斷上升[1]。其中腦卒中的高死亡率已經(jīng)超越了冠心病,成為了全球第二大死因[2];此外,阿爾茨海默病也造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和健康負(fù)擔(dān)[3]。由于血腦屏障(blood⁃brain barrier,BBB)的存在,很多疾病都沒(méi)有有效的治療方法和治療藥物,CNS疾病成為21世紀(jì)人類(lèi)健康的主要威脅之一[4]。
小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)是1個(gè)長(zhǎng)為21~25個(gè)核苷酸序列的雙鏈RNA,能夠與目的基因序列互補(bǔ)并誘導(dǎo)降解相應(yīng)的mRNA,使得mRNA無(wú)法翻譯成蛋白質(zhì),從而達(dá)到治療疾病的目的[5]。因此,siRNA若通過(guò)合理的序列設(shè)計(jì),理論上可以沉默任何與疾病相關(guān)的基因表達(dá),包括導(dǎo)致CNS疾病發(fā)生的基因[6]。siRNA具有對(duì)致病靶點(diǎn)的高度特異性、高效性,以及候選藥物開(kāi)發(fā)的快速、簡(jiǎn)單性,這使得siRNA對(duì)CNS疾病的治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[7]。但是裸露的siRNA也存在著一些問(wèn)題,比如粒徑小,容易被腎臟過(guò)濾[8];穩(wěn)定性差,易被血液中的核酸內(nèi)切酶水解,免疫細(xì)胞的吞噬降解[9⁃10];雖然siRNA本身在沉默基因時(shí)具有強(qiáng)的靶向性,但是它在傳遞過(guò)程中沒(méi)有靶向性,這就可能造成一些靶外效應(yīng),產(chǎn)生一些無(wú)法估計(jì)的不良反應(yīng)[11];siRNA帶負(fù)電荷,很難穿透BBB和靶細(xì)胞,無(wú)法徹底發(fā)揮出siRNA的基因沉默作用[12];即使siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),也沒(méi)有辦法逃逸內(nèi)涵體和溶酶體[13⁃14]。因此siRNA需要一個(gè)合適的載體,來(lái)克服其自身存在的缺點(diǎn)。隨著納米技術(shù)的發(fā)展,載體的種類(lèi)變得多樣化[15],這為實(shí)現(xiàn)siRNA藥物腦部遞送提供可能。本文主要對(duì)siRNA腦部遞送的納米遞送系統(tǒng)進(jìn)行綜述,分別論述納米載體在體內(nèi)傳送過(guò)程中所遇到的障礙,并總結(jié)每種載體的優(yōu)缺點(diǎn),試圖探尋適用siRNA腦部遞送的載體。
1 siRNA納米遞送載體的傳遞障礙
siRNA納米遞送系統(tǒng)在體內(nèi)傳遞過(guò)程中,一般會(huì)遇到3大障礙:體循環(huán)障礙、BBB、溶酶體和內(nèi)涵體屏障。
siRNA的遞送載體在進(jìn)入體循環(huán)后要在血液中保持一定的穩(wěn)定性。但是納米載體作為外源性物質(zhì),容易被各種血漿蛋白標(biāo)記,經(jīng)過(guò)調(diào)理素作用,容易被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(mononeuclear phagocyte system,MPS)吞噬降解[16]。納米載體的大小也會(huì)影響其在血液中的傳遞。研究表明,小于10nm的納米顆粒會(huì)被腎臟清除,大于200nm的納米顆粒會(huì)聚集在肝臟、脾臟及骨髓中,一般認(rèn)為小于100nm的納米顆粒適合腦內(nèi)給藥[17]。納米載體表面的Zeta電位小于-10mV時(shí),容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system,RES)攝取。Zeta電位大于10mV時(shí)則容易吸附血漿蛋白,也會(huì)增加在外周細(xì)胞的攝取,除此之外,還會(huì)造成溶血和血小板的聚集現(xiàn)象[18]。接近中性的納米粒,具有更長(zhǎng)的循環(huán)半衰期,不良反應(yīng)更少。因此,大部分學(xué)者認(rèn)為,納米載體的親水性修飾或者多肽修飾后,可以改善納米載體的表面性質(zhì),從而減少與血漿蛋白的結(jié)合[19]。因此,納米載體的尺寸、表面電荷及表面修飾等特性,直接影響其體內(nèi)分布及循環(huán)時(shí)間的長(zhǎng)短。
在CNS中已經(jīng)形成了多種生理屏障,來(lái)保護(hù)大腦免受病毒、細(xì)菌,以及其他有害物質(zhì)的侵害,這些屏障主要包括了BBB、血⁃腦脊液屏障(blood⁃cerebro⁃spinal fluid barrier,BCSFB)、血⁃視網(wǎng)膜屏障(blood⁃retinal barrier,BRB)、血⁃脊髓屏障(blood⁃spinal cord barrier,BSCB)[20]。BBB位于腦實(shí)質(zhì)和血液循環(huán)之間,由腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(brain capillary endothelial cells,BCECs)、細(xì)胞外基膜、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等組成(圖1[21]),是限制98%小分子和近100%大分子藥物進(jìn)入大腦的主要屏障[22⁃23]。
1.2.2 生理轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
人類(lèi)大腦在生理狀態(tài)下吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及排出廢物主要依賴(lài)生理轉(zhuǎn)運(yùn)途徑來(lái)完成(圖2)[21]。
①簡(jiǎn)單擴(kuò)散:部分水溶性的小分子依賴(lài)緊密連接處的細(xì)胞旁路途徑的簡(jiǎn)單擴(kuò)散完成運(yùn)輸(圖2A)[24]。②跨細(xì)胞親脂途徑:相對(duì)分子質(zhì)量<400~600的脂溶性分子可直接溶解在細(xì)胞膜中而穿透BBB,這類(lèi)物質(zhì)主要有乙醇、麻醉劑、尼古丁、苯二氮類(lèi)等物質(zhì)(圖2B)[25]。③載體介導(dǎo)(carrier⁃mediated transcytosis,CMT):人體中許多極性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如葡萄糖、氨基酸、核苷酸、維生素等無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散和跨細(xì)胞親脂途徑穿過(guò)BBB,但是腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上存在大量?jī)?nèi)源性載體,可以將內(nèi)源性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)高選擇性的膜結(jié)合載體系統(tǒng)在血液和腦組織之間進(jìn)行物質(zhì)交換[21](圖2C)。④外排泵:外排泵是產(chǎn)生耐藥性的主要原因(圖2D),也是大腦清除毒素關(guān)鍵因素,產(chǎn)生這2種作用的關(guān)鍵蛋白主要是多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein,MRP)和P⁃糖蛋白(P⁃glycoprotein,P⁃gp)[26],盡管抑制外排泵策略能達(dá)到增加藥物入腦的效果,但是也同樣增加了有害物質(zhì)進(jìn)入大腦的風(fēng)險(xiǎn)[24]。⑤受體介導(dǎo)(receptor⁃mediated transcytosis,RMT):RMT的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)是攝取胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗體、多肽等大分子物質(zhì)的主要途徑(圖2E)。RMT的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)主要分3個(gè)步驟完成:首先,藥物與腦內(nèi)皮細(xì)胞的受體特異性結(jié)合,誘導(dǎo)受體發(fā)生交聯(lián)或構(gòu)象變化,此時(shí)細(xì)胞向內(nèi)凹陷,產(chǎn)生內(nèi)吞,形成細(xì)胞內(nèi)小泡;然后,細(xì)胞內(nèi)小泡在內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中移動(dòng)至細(xì)胞的另一側(cè);最后,在腦內(nèi)皮細(xì)胞的近腔側(cè),核內(nèi)體酸化后受體與配體解離,排出化合物,從而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)[22]。⑥吸附介導(dǎo)(adsorptive mediated transcytosis,AMT):AMT的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)則是利用帶正電的多肽與帶負(fù)電的細(xì)胞膜之間的靜電作用進(jìn)行的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)(圖2F)。與RMT相比,AMT雖然具有穿透性能好、容量大的優(yōu)點(diǎn),但也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)比如缺乏組織選擇性、外周毒性、BBB的破壞等[25]。⑦細(xì)胞介導(dǎo):血管周?chē)奘杉?xì)胞和吞噬細(xì)胞可以頻繁在BBB的內(nèi)外兩側(cè)遷移,以保護(hù)CNS免受病原體侵襲,特別是腦部炎癥反應(yīng)的病理狀態(tài)下,比如卒中、多發(fā)性硬化癥等,這種遷移的頻率會(huì)增加(圖2G)[21]。細(xì)胞介導(dǎo)雖然是一種新的、有效的跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,但是細(xì)胞的穩(wěn)定性差、載藥量低,限制了其在腦部應(yīng)用[27]。
1.2.3 穿透BBB的方法
依據(jù)上述的生理轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,科學(xué)家們已經(jīng)找到了2種穿過(guò)BBB的方法,侵入性與非侵入性[21,25]。侵入性的方法主要包括腦室內(nèi)灌注(intra⁃ce⁃rebro⁃ventricular infusion,ICV)、對(duì)流增強(qiáng)遞送(convection⁃enhanced delivery,CED)、植入CNS后直接釋放治療藥物的聚合物或微芯片系統(tǒng)、采用物理化學(xué)等方法(聚焦超聲、微波能量、電磁脈沖、甘露醇、阿拉伯膠、緩激肽等)進(jìn)行BBB的瞬時(shí)破壞,但是這些方法可能會(huì)造成BBB的完整性和生理功能永久喪失,導(dǎo)致有害物質(zhì)在大腦中積累,最終對(duì)大腦造成不可逆的損傷。阿拉伯糖、內(nèi)酰胺等滲透促進(jìn)劑的使用可能會(huì)造成腦水腫以及癲癇發(fā)作。保證BBB完整性是安全入腦的必要條件,因此AMT、RMT、CMT跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、抑制外排泵途徑、細(xì)胞介導(dǎo)途徑等非侵入性穿過(guò)BBB是一種相對(duì)安全的方法。
1.2.4 鼻腦轉(zhuǎn)運(yùn)通路
除上述途徑外,非侵入性的方法還包括鼻腦轉(zhuǎn)運(yùn)通路。鼻腔給藥主要是通過(guò)嗅球、三叉神經(jīng)、脈管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)繞過(guò)BBB到達(dá)神經(jīng)中樞,是一種無(wú)創(chuàng)、安全、有前途的治療方法,但這種途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)劑量和轉(zhuǎn)運(yùn)效率都很低[28⁃29]。
由于A(yíng)MT的非選擇性,CMT、細(xì)胞介導(dǎo)、鼻腔給藥的局限性,抑制外排泵的危險(xiǎn)性,RMT的跨細(xì)胞途徑成為研究者們的首選方法。RMT地跨BBB方式不僅有很高的選擇性,且該轉(zhuǎn)運(yùn)方式既可以轉(zhuǎn)運(yùn)特定的配體,也能轉(zhuǎn)運(yùn)配體功能化的偶聯(lián)物或者納米粒子,因而成為納米藥物靶向穿過(guò)BBB的最重要方式[30]。BBB的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種受體(圖3),比如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor,TfR)、低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor related protein,LRP)、煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors,NAchR)等,而且在某些特定病理?xiàng)l件下表達(dá)上調(diào)[24]。
2 納米遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展
目前獲得FDA批準(zhǔn)上市的siRNA藥物(表1)已經(jīng)有5種[39],siRNA藥物的成功,也再次證明了載體的重要性,但已上市藥物中沒(méi)有1種用于治療CNS疾病。
下面筆者將詳細(xì)介紹脂基納米粒、殼聚糖納米粒、聚乙烯亞胺納米粒、樹(shù)狀大分子、納米凝膠、納米膠束、細(xì)胞及外泌體等作為siRNA藥物載體用于腦部藥物遞送的研究進(jìn)展及其優(yōu)缺點(diǎn)。
脂質(zhì)體用于穿過(guò)BBB研究主要通過(guò)脂質(zhì)體表面的功能化,如多肽、抗體或小分子等生物活性配體的修飾,使得脂質(zhì)體具有靶向穿透BBB的能力[43]。G⁃TechnologyⓇ是脂質(zhì)體包載阿片肽(DAMGO)一種新技術(shù),其表面修飾的聚乙二醇(PEG)⁃谷胱甘肽,使得脂質(zhì)體不僅能夠長(zhǎng)循環(huán),還能與BBB表面大量表達(dá)的谷胱甘肽受體特異性結(jié)合促進(jìn)藥物進(jìn)入大腦,使得DAMGO在大鼠大腦中的攝取量增加1倍[44]。狂犬病病毒肽(rabies virus glycoprotein,RVG)肽來(lái)源于狂犬病毒的糖蛋白,能夠特異性靶向BBB、鼻腔及神經(jīng)細(xì)胞共同表達(dá)的煙堿乙酰膽堿受體(acetylcholine receptors,ACHR),因此受到研究者們的廣泛關(guān)注[45]。Bender等[46]將siRNA以靜電方式與陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合,并將狂犬病毒糖蛋白片段肽(RVG⁃9R)多肽修飾在脂質(zhì)體的表面,用于BBB的穿透以及神經(jīng)退行性疾病的治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該納米遞藥系統(tǒng)成功地將siRNA主動(dòng)遞送至神經(jīng)元中,并顯著降低了該神經(jīng)元中致病基因的表達(dá)。此外雙肽修飾脂質(zhì)體使得BBB和腫瘤細(xì)胞的穿透能力進(jìn)一步增強(qiáng)[47]。血管肽Angiopep⁃2是源于Kunitz結(jié)構(gòu)域的一種配體,可同時(shí)被BBB表面表達(dá)的LDLR和膠質(zhì)瘤(glioblastoma multiforme,GBM)表達(dá)的LRP受體的識(shí)別,且無(wú)內(nèi)源性,與轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白等其他蛋白質(zhì)相比,具有更強(qiáng)的腦穿透能力[48]。Angiopep⁃2與紫杉醇的偶聯(lián)物已經(jīng)進(jìn)入臨床,這再次證明Angiopep⁃2在腦靶向中的地位[49]。但是Angiopep⁃2只能用來(lái)靶向GBM的表面,無(wú)法穿透GBM的深層組織,因此Yang等[50]將Angiopep⁃2肽和腫瘤歸巢肽(tLyP⁃1)同時(shí)修飾脂質(zhì)體的表面,并負(fù)載siRNA用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療,體內(nèi)近紅外熒光成像表明,雙肽修飾的脂質(zhì)體在大腦中的熒光分布最為強(qiáng)烈;BBB模型表明,一定濃度的脂質(zhì)體在體外穿過(guò)BBB時(shí)對(duì)緊密連接無(wú)明顯影響,因此,這種雙肽修飾的脂質(zhì)體系統(tǒng)為siRNA穿透BBB并靶向GBM提供了一種安全、無(wú)創(chuàng)的途徑。
作為siRNA遞送載體,脂質(zhì)體不適合腦部遞送。原因是可以與其他帶有負(fù)電荷的細(xì)胞內(nèi)組分(例如血清蛋白和酶)進(jìn)行非特異性的相互作用,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞黏附下降、溶血和轉(zhuǎn)染效率降低。另外,在制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體的過(guò)程中可能會(huì)引入乙醚、氯仿等有機(jī)試劑,會(huì)對(duì)細(xì)胞和組織造成傷害[51⁃52]。
2.1.2 固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles,SLNs)
SLNs是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的新一代亞微粒給藥系統(tǒng),這種類(lèi)型的納米顆粒主要以固態(tài)天然或合成的類(lèi)脂如卵磷脂、三酰甘油等為載體,具有良好的生物相容性與低細(xì)胞毒性。該載體可以將藥物包裹或夾嵌于類(lèi)脂核中制成實(shí)心固體膠粒給藥系統(tǒng),因此在結(jié)構(gòu)上與脂質(zhì)體存在顯著區(qū)別[23,53]。該納米載體經(jīng)過(guò)表面修飾后可顯著提高BBB的穿透效率[54]。Rassu等[56]設(shè)計(jì)了一種高效的鼻腔給藥系統(tǒng),用于阿爾茨海默病的治療。他們先將RVG肽與帶正電的精氨酸偶聯(lián)組成RVG⁃9R復(fù)合物,該復(fù)合物可以與siRNA通過(guò)靜電作用相互結(jié)合;接著,將RVG⁃9R⁃siRNA復(fù)合體包裹在SLNs中,極大提高了siRNA的穩(wěn)定性;為了延長(zhǎng)SLNs在鼻腔中的停留時(shí)間,又在其表面添加了殼聚糖涂層。單層Caco⁃2細(xì)胞滲透性實(shí)驗(yàn)表明,該納米遞送系統(tǒng)顯著促進(jìn)siR⁃NA在BBB的滲透。然而,它們的疏水性促進(jìn)了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除,從而降低了納米顆粒的有效性[23]。
2.1.3 納米乳
納米乳液是由表面活性劑穩(wěn)定的“水包油”(O/W)或“油包水”(W/O)組合物的非均相分散體。這些納米粒子的表面也可以用生物活性配體進(jìn)行修飾,通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞穿透BBB。與其他納米載體相比,納米乳劑對(duì)BBB滲透的優(yōu)勢(shì)是能夠使用安全的油脂,因而產(chǎn)生的毒性更小[23]。最近,納米乳已廣泛用于鼻腔給藥的研究,原因是鼻腔給藥可以有效地避免肝臟的首過(guò)代謝,減少藥物在非靶向組織的蓄積,從而將全身副作用降至最低[57]。Elizan⁃dra等[58]使用卵磷脂、(2,3⁃二油;⁃丙基)⁃三甲基氯化銨(1,2⁃Dioleoyl⁃3⁃trimethyl ammonium⁃propane chloride,DOTPA)等材料采用高壓均質(zhì)法制備了陽(yáng)離子納米乳。DOTPA通過(guò)靜電結(jié)合的方式與siRNA結(jié)合,經(jīng)過(guò)吸附、封裝到達(dá)水相中,這種方法既簡(jiǎn)單又實(shí)用,可以很好地解決siRNA穩(wěn)定性差等劣勢(shì)。通過(guò)鼻腔給藥,繞開(kāi)BBB,到達(dá)中樞細(xì)胞發(fā)揮基因沉默作用[59]。納米乳液的熱力學(xué)不穩(wěn)定性缺陷,仍然需要進(jìn)一步考慮[23]。
2.1.4 脂質(zhì)納米粒(lipid nanoparticles,LNP)
與SLNs類(lèi)似,LNP是一種具有球形結(jié)構(gòu)、粒徑在10~1000nm、包含脂質(zhì)成分的納米粒子,作為基因藥物(mRNA疫苗、siRNA、質(zhì)粒DNA)的遞送載體一直備受大家的關(guān)注[60]。其實(shí)LNP作為藥物載體一直用于肝靶向。第1個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)的藥物(ONPATTRO)就是以L(fǎng)NP作為siRNA載體治療家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變[61]。處方組成主要有膽固醇、二硬脂;字D憠A(Distearoyl phosphatidylcholine,DSPC)、Dlin⁃MC3⁃DMA、聚乙二醇脂質(zhì)[(R)2,3⁃bis(octadecyloxy)propyl⁃1⁃(methoxy polyethylene glycol2000)carbamate,PEG2000⁃C⁃DMG]。膽固醇用于調(diào)節(jié)脂質(zhì)膜流動(dòng)性;DSPC組成脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu),包裹藥物;DLin⁃MC3⁃DMA是具有專(zhuān)利保護(hù)的新型材料,它最大的優(yōu)點(diǎn)就是在酸性條件下可以和siRNA發(fā)生靜電結(jié)合,在人體內(nèi)保持電中性,使毒性減少,被細(xì)胞吞噬后,內(nèi)涵體中的酸性環(huán)境使組分中的氨基質(zhì)子化,質(zhì)子化后的聚合物帶有正電荷可以和帶負(fù)電荷的內(nèi)涵體膜融合,使siRNA逃逸并釋放到細(xì)胞質(zhì)中[62]。除此之外,DLin⁃MC3⁃DMA還可以避免被巨噬細(xì)胞吞噬,以及在肝臟中聚集,這是目前用于沉默肝臟靶點(diǎn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”陽(yáng)離子脂質(zhì)[60]。PEG2000⁃C⁃DMG的使用延長(zhǎng)了siRNA在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,增加了siRNA進(jìn)入到靶細(xì)胞的可能[63]。
LNP在腦部遞送方面與肝臟類(lèi)似,均是利用LNP中的陽(yáng)離子脂質(zhì)吸附內(nèi)源性的載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)從而完成腦部穿透[64]。然而采用靜脈注射LNP后,可能造成肝部積累,無(wú)法到達(dá)腦部。所以鞘內(nèi)和腦室間給藥成為L(zhǎng)NP siRNA系統(tǒng)的另外一種給藥方式,用于治療嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,但這種給藥方式存在一定危險(xiǎn)性[60]。Bruun等[65]設(shè)計(jì)出一種安全性高、穿透性能好的LNP用于傳遞siRNA并進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤的治療。此載體的關(guān)鍵點(diǎn)在于將Angiopep連接到LNP表面,以實(shí)現(xiàn)BBB和腦膠質(zhì)瘤的雙級(jí)靶向;其次,帶正電的LNPs被帶負(fù)電荷的聚乙二醇化的可裂解脂肽掩蓋降低了載體的毒性,這種可裂解肽會(huì)被在腫瘤微環(huán)境和炎癥性BBB表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)識(shí)別并切割,從而觸發(fā)LNP電荷從弱負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾,有利于?xì)胞內(nèi)吞和siRNA的釋放,從而實(shí)現(xiàn)高沉默效率[65],然而LNP的毒性一直沒(méi)有得到很好的解決[15]。
2.2 殼聚糖納米粒
殼聚糖是天然的生物大分子,具有良好的生物相容性,細(xì)胞攝取率高,載藥量大。分子鏈上的氨基、羥基、N⁃乙酰氨基等均可與siRNA鏈形成分子間氫鍵,因而被廣泛應(yīng)用于siRNA等核酸類(lèi)藥物的遞送[66]。Gao等[67]用一種三甲基殼聚糖(trimethylated chitosan,TMC)作為藥物載體,并用RVG肽進(jìn)行修飾,構(gòu)建了一種高效、低毒的siRNA納米遞送系統(tǒng)。該研究表明,三甲基化的殼聚糖提高了自身的溶解度以及對(duì)siRNA的緊密壓縮,不僅增加了siRNA血清穩(wěn)定性,降低細(xì)胞毒性,而且能夠產(chǎn)生高效的細(xì)胞攝取和有效的基因沉默效率。Sarvaiya等[68]詳細(xì)描述了殼聚糖及其衍生物作為siRNA載體在治療阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)中的巨大優(yōu)勢(shì)。AD是一種慢性疾病,需要藥物在大腦中緩慢地釋放并發(fā)揮作用,納米載體在體內(nèi)的降解速率是治療該疾病的關(guān)鍵。該文章表明使用三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate,STPP)作為載體的交聯(lián)劑,比使用戊二醛交聯(lián)殼聚糖納米顆粒降解更慢,因此可以獲得更好的緩釋效果。另外,殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量也是影響藥物緩釋作用的關(guān)鍵,實(shí)驗(yàn)證明高、中相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖比低相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖緩釋效果更明顯。TMC在治療AD方面的優(yōu)勢(shì),因?yàn)閹в姓姾傻腡MC會(huì)和BBB上的陰離子唾液酸殘基發(fā)生靜電結(jié)合,從而促進(jìn)納米顆粒穿透BBB。此外,殼聚糖聚乙二醇化后并用聚山梨酯80包裹也能促進(jìn)藥物穿透BBB[68]。
盡管殼聚糖在安全性方面得到很好的保證,但是作為siRNA的遞送載體,與某些優(yōu)良的載體相比提升轉(zhuǎn)染效率有限[69],在siRNA遞送應(yīng)用方面受到了一定的限制。
2.3 聚乙烯亞胺納米粒
PEI是一種陽(yáng)離子聚合物,是研究最多的基因載體材料之一,它具有良好的溶解度,在內(nèi)涵體/溶酶體途徑中具有pH緩沖能力,能與帶有負(fù)電荷的siRNA發(fā)生靜電結(jié)合形成納米復(fù)合物[70]。高相對(duì)分子質(zhì)量PEI的優(yōu)勢(shì)主要有提高細(xì)胞攝取和溶酶體逃逸,增強(qiáng)藥效,但是PEI有個(gè)很大的缺點(diǎn)就是對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[71]。因此具有低毒性的低相對(duì)分子質(zhì)量(1800)[72]、線(xiàn)性的PEI[73]開(kāi)始受到人們的關(guān)注。德國(guó)馬爾堡菲利普大學(xué)的研究人員[74]就是選用一種名為PEI⁃F25⁃LMW低相對(duì)分子質(zhì)量的PEI作為藥物載體,實(shí)驗(yàn)證明這種載體具有低細(xì)胞毒性和高生物活性。為了使整個(gè)納米載體具有一定的靶向性,他們選用了一種在BBB細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞高表達(dá)的白喉素受體(diphtheria toxin recep⁃tor,DTR)的配體(CRM197)偶聯(lián)到PEI⁃F25⁃LMW上,通過(guò)RMT的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。實(shí)際上PEI產(chǎn)生毒性的原因就是因?yàn)槲幢恍揎椀木酆衔锉砻鎺в泻芏嗾姾,正電荷的存在?huì)轉(zhuǎn)染到其他細(xì)胞中,造成嚴(yán)重的毒性。即使使用低相對(duì)分子質(zhì)量的PEI也不能完全避免毒性的產(chǎn)生。因此用聚乙二醇(PEG)對(duì)納米粒子進(jìn)行修飾,PEG不僅可以屏蔽表面電荷還可以減少多聚體的形成[75]。Park等[76]開(kāi)發(fā)了一種名為聚甘露醇共PEI基因轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[poly(mannitol⁃co⁃PEI)gene transporter,PMT]的聚合物載體用作siRNA的轉(zhuǎn)運(yùn),來(lái)治療阿爾茨海默病。PMT在生理?xiàng)l件下水解成低相對(duì)分子質(zhì)量的PEI和甘露醇,甘露醇的使用一方面屏蔽了PEI剩余的正電荷降低毒性,另一方面還能刺激小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,避免溶酶體對(duì)siRNA降解。PEG的使用也是為了降低載體的非特異性穿透,RVG靶向肽的修飾大大增加了納米粒子的靶向穿透BBB的能力。單層膜跨上皮電阻(transepithelial electrical resistance,TEER)值測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明,納米該載體對(duì)BBB的損害較小,可以忽略不計(jì),并且通過(guò)RVG介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。整體來(lái)說(shuō)RVG⁃PEG⁃PMT能成功穿透BBB,并抑制淀粉蛋白前β⁃分解酶1(serum beta⁃secretase1,BACE1)基因發(fā)揮抗AD的治療作用。
2.4 樹(shù)狀大分子納米粒
樹(shù)枝狀大分子由內(nèi)部核心、內(nèi)部支化官能團(tuán)及外部表面基團(tuán)3部分組成,高度支化,呈輻射狀,具有精確的三維空間結(jié)構(gòu)。內(nèi)部的空腔及內(nèi)部支化官能團(tuán)可用于攜帶基因藥物分子,作為定向運(yùn)輸?shù)妮d體,外部表面基團(tuán)經(jīng)靶向修飾后可提高藥物的穩(wěn)定性,并增強(qiáng)主動(dòng)靶向效率[77]。陽(yáng)離子型聚酰胺⁃胺樹(shù)枝狀大分子(polyamidoamine dendrimer,PAMAM)活性氨基所攜帶的正電荷和分支性結(jié)構(gòu)為siRNA的包封和壓縮提供了便利。在水溶液中,PAMAM可與siRNA通過(guò)靜電作用結(jié)合形成納米復(fù)合物,所得納米復(fù)合物具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和生物可降解性;同時(shí)該載體所攜帶的正電性的氨基可增加細(xì)胞攝取和溶酶體逃逸能力[66]。
Huang等[78]利用PAMAM作為基因藥物的遞送載體治療腦膠質(zhì)瘤,并通過(guò)Angiopep⁃2肽的修飾,使載體具有主動(dòng)靶向功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用Angiopep⁃2修飾后的納米粒在腦部腫瘤的分布比未修飾的納米粒顯著更多。后來(lái)研究者們將RGD肽[79]、tLyp⁃1[80]肽與PAMAM連接,用于BBB的穿透和腦部腫瘤的治療。但是PAMAM的毒性一直沒(méi)有得到很好的解決,研究者[81]用一種聚⁃L⁃賴(lài)氨酸(poly⁃l⁃ly⁃sines,DGLs)樹(shù)狀大分子來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的聚酰胺⁃胺樹(shù)狀大分子,原因是DGLs有著更高的基因轉(zhuǎn)染能力、更低的細(xì)胞毒性、更好的生物降解的能力。T7肽修飾之后,使得載體具有可同時(shí)靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和許多惡性腫瘤細(xì)胞上過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的能力,而且這種配體與轉(zhuǎn)鐵蛋白相比具有較好的穩(wěn)定性、較小的空間位阻、臨床應(yīng)用潛力大等特點(diǎn),使得載體穿透BBB的優(yōu)勢(shì)更加明顯[82]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都證明了該載體具有良好的靶向穿透BBB和膠質(zhì)細(xì)胞瘤的能力。
2.5 納米凝膠
具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的納米凝膠在載藥方面有很多優(yōu)點(diǎn),比如高載藥量、避免酶對(duì)藥物的降解、降低被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬的風(fēng)險(xiǎn)。若將納米凝膠作為siRNA的藥物載體可增強(qiáng)siRNA的穩(wěn)定性,避免核酸酶的降解,還可以通過(guò)表面修飾增強(qiáng)靶向性和安全性[66]。
Ding等[83]設(shè)計(jì)了1種包覆多巴胺(PDA)的核酸納米凝膠,作為siRNA介導(dǎo)的低溫光熱療法的治療復(fù)合物,極大提高了siRNA的穩(wěn)定性。聚N⁃異丙基丙烯酰胺(Poly N⁃isopro⁃pyl acrylamide,PNIPAM)是一種熱響應(yīng)性聚合物,在其低臨界溶解溫度(lower critical solution temperature,LCST)下表現(xiàn)出疏水⁃親水相變,因此在特定溫度下可以形成納米凝膠[84]。通過(guò)該材料形成納米凝膠不僅具有無(wú)毒、高載藥特性,而且能與BBB表面表達(dá)的清道夫受體結(jié)合,實(shí)現(xiàn)BBB的高效穿透[85⁃86]。Jiang等[87]將siRNA與PNIPAM通過(guò)二硫鍵偶聯(lián)制備出一種新型無(wú)陽(yáng)離子siRNA納米載體,該納米載體不僅具有更長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間、強(qiáng)大的BBB滲透、有效的細(xì)胞攝取,還能夠促進(jìn)siRNA在細(xì)胞中釋放,保證siRNA藥效的發(fā)揮。但是制備納米凝膠需要高昂的設(shè)備,以及在生產(chǎn)過(guò)程可能帶來(lái)一定的毒性[24]。
2.6 納米膠束
聚合物膠束是由合成的兩親性嵌段共聚物在水中自組成的一種熱力學(xué)穩(wěn)定的膠束溶液。膠束作為藥物載體有很多優(yōu)點(diǎn),它可以增加難溶藥物的溶解度,具有高滲透長(zhǎng)滯留(enhanced permeability and retention effect,EPR)效應(yīng),提高藥物的生物利用度,若在親水外殼用葉酸、多肽、抗體等修飾可使靶向性增加,親水段的PEG部分具有長(zhǎng)循環(huán)的效果[88⁃89]。
Huo等[90]選取了PEG化的聚天冬氨酰肼衍生物形成的聚離子復(fù)合膠束用于siRNA腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。為了解決跨BBB的問(wèn)題,他們選用RVG作為靶向穿透肽,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RVG修飾的膠束比未修飾的膠束在Neuro2a細(xì)胞的攝取率更高,體內(nèi)生物分布研究表明用RVG修飾膠束,可以通過(guò)BBB。總的來(lái)說(shuō),該納米載體有著良好的分散性,較低的細(xì)胞毒性,血清穩(wěn)定性好,體外沉默效率高。然而,膠束在水性環(huán)境中熱力學(xué)穩(wěn)定差,稀釋后容易解聚,且在血液環(huán)境中不夠穩(wěn)定,提升膠束穩(wěn)定性及遞送效率是目前重要的研究方向[23]。
2.7 外泌體
外泌體是活細(xì)胞吞噬異源物質(zhì)后以出芽方式向內(nèi)凹陷形成的含有多個(gè)小泡的多泡體,再由多泡體與細(xì)胞膜融合而釋放的小囊泡,是細(xì)胞外囊泡的1個(gè)亞型,直徑在40~100nm[91]。外泌體最初是在綿羊紅細(xì)胞的上清液中發(fā)現(xiàn),當(dāng)初被認(rèn)為是活細(xì)胞分泌的“廢物”,后來(lái)發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等多種生物大分子,所以被用來(lái)當(dāng)作各種藥物載體[92]。外泌體負(fù)載siRNA的方法并不是像傳統(tǒng)陽(yáng)離子載體一樣通過(guò)靜電吸附,而是利用孵育、電穿孔、轉(zhuǎn)染試劑等措施來(lái)實(shí)現(xiàn)。外泌體作為siRNA藥物載體在腦部的應(yīng)用也有不少文獻(xiàn)報(bào)道。
EL⁃Andaloussi等[93]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用RVG修飾到樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的外泌體表面可以穿透BBB。Yang等[94]首次用腦內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體作為siRNA載體并穿透BBB。腦內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體表面含有四跨膜蛋白Tetraspanin、CD63、CD81、CD9,依靠這些蛋白可以和BBB、原代膠質(zhì)細(xì)胞相互作用,促進(jìn)細(xì)胞間的交流。激活細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色研究表明,野生型外泌體顯著增加了腦內(nèi)皮細(xì)胞中熒光標(biāo)記siRNA的攝;轉(zhuǎn)運(yùn)研究中,外泌體還增強(qiáng)了羅丹明123在共培養(yǎng)的腦內(nèi)皮細(xì)胞bEND單層中的通透性,此外,在異種移植腦瘤模型中,外泌體遞送的VEGF siRNA斑馬魚(yú)大腦中標(biāo)記癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。腦內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體可能被用作外源性siRNA腦傳遞的天然載體。2019年,Reynolds等[95]利用小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體通過(guò)BBB向目的細(xì)胞遞送siRNA。該研究主要是通過(guò)沉默Tspan2基因,來(lái)降低Tspan2控制的CXCL12和CXCR4的水平,來(lái)減少由HIV⁃1感染所造成的神經(jīng)炎癥。外泌體是一個(gè)非常有前景的藥物載體,但是目前還處于研究階段[92]。
2.8 細(xì)胞
細(xì)胞作為藥物載體具有免疫原性低、血液循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)、特異性靶向、高安全性及突破生理屏障等特點(diǎn),已成為現(xiàn)代藥物載體研究的熱點(diǎn)[27]。目前,紅細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、干細(xì)胞及癌細(xì)胞等都被用作藥物載體,治療炎癥、癌癥、代謝紊亂等不同種類(lèi)的疾病[96⁃97]。
在穿透BBB的應(yīng)用中,部分研究者利用免疫細(xì)胞對(duì)腦部疾病產(chǎn)生炎癥的趨向性以及可穿透BBB的特性,直接以單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞作為藥物載體穿透BBB[57]。Xue等[98]以嗜中性粒細(xì)胞作為藥物載體,負(fù)載紫杉醇脂質(zhì)體,用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療。其優(yōu)勢(shì)在于降低脂質(zhì)體毒性的同時(shí),將紫杉醇安全遞送至腫瘤部位,減緩了腫瘤的生長(zhǎng),提高小鼠的存活率。曾有研究用單核細(xì)胞介導(dǎo)超順磁氧化鐵納米粒子SHP30的轉(zhuǎn)運(yùn),并滲透進(jìn)入腦部炎癥區(qū)域[99]。未被修飾的細(xì)胞展現(xiàn)出了良好的腦部遞送能力,被配體修飾的細(xì)胞則進(jìn)一步增加了穿透BBB的能力。Fu等[100]將T7肽和NGR肽修飾在紅細(xì)胞膜的表面,并負(fù)載長(zhǎng)春新堿SLNs,使載體不僅具有高度仿生能力,還擁有雙重靶向能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該納米遞送系統(tǒng)具有良好的抗膠質(zhì)瘤作用。此外,配體修飾紅細(xì)胞或者其他細(xì)胞完成高效的腦部遞送還有很多[101⁃103]。
但是很多學(xué)者表示,盡管細(xì)胞遞送展現(xiàn)出無(wú)窮大的潛力,但是載藥量低、過(guò)早釋放及穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)限制了細(xì)胞作為藥物載體的廣泛應(yīng)用[104]。
2.9 siRNA綴合物
早期siRNA綴合物的出現(xiàn),是為了增加siRNA的穩(wěn)定性,即通過(guò)化學(xué)合成的方法將不同的化合物分子共價(jià)結(jié)合在不影響siRNA藥效的正義鏈或反義鏈上[105]。這類(lèi)載體主要有特定功能化的小分子⁃siRNA綴合物、多糖⁃siRNA單綴合物、磷脂⁃siRNA單/雙綴合物、膽固醇⁃siRNA單綴合物、肽⁃siRNA單/雙綴合物、PEG⁃siRNA單綴合物、抗體/適配體⁃siRNA單綴合物、芳香環(huán)系⁃siRNA單綴合物、交聯(lián)枝化聚合物⁃siRNA單綴合物、垂懸枝狀聚合物⁃siRNA單綴合物及聚合物⁃siRNA雙綴合物等[106],F(xiàn)如今,多肽⁃siRNA綴合物已經(jīng)開(kāi)始用于腦部遞送,這里主要集中在細(xì)胞穿透肽(CPPs)⁃siRNA和配體⁃siRNA。
2.9.1 CPPs⁃siRNA
細(xì)胞穿透肽(cell⁃penetrating peptides,CPPs)由5~30個(gè)氨基酸組成,在生物學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。一般來(lái)說(shuō),含有賴(lài)氨酸或精氨酸殘基的CPPs在生理pH水平上帶正電荷,以便有效地與帶負(fù)電的細(xì)胞膜相互作用[107]。Yu等[108]曾用低相對(duì)分子質(zhì)量的魚(yú)精蛋白作為細(xì)胞穿透肽,中間接枝PEG,并通過(guò)二硫鍵與siRNA共價(jià)結(jié)合。該研究表明,與傳統(tǒng)的靜電吸附CPPs/siRNA聚集體相比,這些偶聯(lián)物不會(huì)產(chǎn)生凝血作用,且表現(xiàn)出更好的RNA干擾效力和細(xì)胞內(nèi)遞送。雖然CPPs來(lái)增加分子貨物通過(guò)細(xì)胞屏障的運(yùn)輸具有顯著的優(yōu)勢(shì),但由于高濃度下的相關(guān)毒性,這些高效的載體一直存在爭(zhēng)議。此外,CPPs或陽(yáng)離子蛋白的非特異性攝取可能導(dǎo)致血管和外周器官中積累更多[22]。
2.9.2 配體⁃siRNA
在上述的討論中可以發(fā)現(xiàn),配體修飾的納米載體具有極佳的腦靶向能力。配體與siRNA的直接偶聯(lián),簡(jiǎn)單易操作,因此越來(lái)越受到科學(xué)家們的青睞。
He等[109]合成了1種甲氧基修飾的siRNA,并通過(guò)其正義鏈中5′端的巰基與環(huán)狀精氨酸⁃天冬氨酸(cRGD)中的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)發(fā)生特異性加成反應(yīng),形成cRGD⁃siEGFR偶聯(lián)物,用于腦膠質(zhì)瘤的治療。體內(nèi)外數(shù)據(jù)表明,該偶聯(lián)物具有毒性低、抗腫瘤作用強(qiáng)等特點(diǎn),有望成為很有前途的藥物。研究者還發(fā)現(xiàn)人黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白(MTf)穿透BBB的效率要大于轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清蛋白。但是完整的MTf與其他大型蛋白質(zhì)載體一樣具有局限性,比如無(wú)法批量生產(chǎn)、改變偶聯(lián)藥物的特性等[110]。Singh等[111]篩選了一種高度保守的12個(gè)氨基酸的多肽,稱(chēng)為MTfp,它保留了穿透完整BBB和進(jìn)入腦部細(xì)胞的能力,同時(shí)不影響藥物的理化特性,并且具有批量生產(chǎn)的能力。Eyford等[112]直接以MTfp與siRNA進(jìn)行化學(xué)連接,生成一種新的多肽⁃寡核苷酸結(jié)合物(POC),并首次證明了在BBB保持完整的CNS疾病模型前提下,有效地穿透BBB,下調(diào)腦卒中致病基因NOX4,從而為目前難以治療的各種神經(jīng)病理中潛在的氧化應(yīng)激神經(jīng)炎癥提供了新的治療手段。
由于多肽偶聯(lián)的siRNA納米載體仍然使siRNA完全暴露在外部環(huán)境中,其穩(wěn)定性受到科學(xué)家們的質(zhì)疑[30]。
通過(guò)RMT的siRNA納米遞藥系統(tǒng)穿透BBB,相較于其他物理、化學(xué)、鞘內(nèi)注射等方式,具有顯著的優(yōu)勢(shì)和前景。納米載體的優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表2,設(shè)計(jì)優(yōu)質(zhì)、高效的納米遞藥系統(tǒng)需要盡可能地達(dá)到以下要求:①載體材料的安全性:人的大腦是一個(gè)特殊的組織器官,對(duì)載體的安全性有很高的要求,所以良好的生物降解性和生物相容性是必要的條件。②不會(huì)在血液中聚集和解離,要保持較長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間。③要有良好的載藥和釋藥能力。④非免疫原性。⑤要有偶聯(lián)基團(tuán),便于連接其他配體等功能性基團(tuán)。⑥要能夠有效、安全地穿透BBB,而不是完全的破壞。⑦要具有良好的靶向能力和內(nèi)涵體/溶酶體逃逸能力。此外,納米載體的表面性質(zhì),例如粒徑大小、表面電荷以及所修飾的配體的密度、配體的親和性等都會(huì)影響納米載體在體內(nèi)的分布以及穿透BBB的效率。
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