摘要: 目的 了解病毒入胞、內(nèi)含體逃逸等機(jī)制,從中得到啟發(fā)為進(jìn)一步設(shè)計(jì)開發(fā)高效智能、仿病毒載藥工具提供幫助。方法 縱觀在長期的進(jìn)化過程中病毒因宿主的殺傷壓力,為生存、復(fù)制延續(xù)所形成的獨(dú)特的跨膜、內(nèi)含體逃逸以及亞細(xì)胞器定位等本領(lǐng),揭示其給我們在仿病毒載藥多肽設(shè)計(jì)開發(fā)方面的啟示。結(jié)果與結(jié)論 對病毒感染機(jī)制全面、深入的了解,有助于我們利用病毒逃避宿主殺傷機(jī)制,為設(shè)計(jì)、研發(fā)高效率非病毒載藥多肽提供新思路。
病毒一般是透過皮膚黏膜屏障,經(jīng)由血液感染靶細(xì)胞而定居于宿主體內(nèi),完成一次感染需要經(jīng)歷:①與細(xì)胞表面的受體結(jié)合;②內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞;③從內(nèi)含體中逃逸;④進(jìn)入特定細(xì)胞器。病毒在漫長的進(jìn)化過程中獲得了諸如逃避殺傷、利用和控制宿主細(xì)胞為自身增殖服務(wù)的本領(lǐng)。筆者以人免疫缺陷型病毒(humanimmunodeficiencyvirus-1,HIV-1)和流感病毒等為例回顧病毒入胞、感染機(jī)制,對借鑒病毒感染機(jī)制,利用病毒逃逸“元件”指導(dǎo)設(shè)計(jì)高效載藥多肽(bio-drugdeliv-eringpeptides)研究作一綜述和展望。
1 病毒入胞和胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制(mechanisms of intracellular trafficking)
病毒感染首先需要和細(xì)胞膜表面蛋白、脂類及糖等分子相結(jié)合[1],其中一部分膜分子是病毒特異性受體,通過結(jié)合病毒表面分子介導(dǎo)入胞;另一部分膜分子則是非特異性黏附因子,起增強(qiáng)與病毒顆粒細(xì)胞表面的結(jié)合與濃集作用。一些病毒僅需要一種受體,例如流感病毒受體為細(xì)胞表面帶有唾液酸的糖蛋白,鼻病毒Ⅱ型(human rhinovirus type2,HRV-2)受體為低密度脂蛋白等;另一些病毒由于初始受體激活的信號(hào)不足以使其入胞,需要招募和活化細(xì)胞表面相關(guān)共受體,共受體和病毒親和力低,在初始受體與病毒結(jié)合后才會(huì)發(fā)揮增強(qiáng)結(jié)合能力的作用。依賴共受體協(xié)助入胞的病毒如HIV-1,其初始受體為CD4,共受體為趨化因子受體CCR5或CX-CR4;JC病毒[2]初始受體為三唾液酸神經(jīng)節(jié)甘酯(GT1b),共受體5HT-2a;柯薩奇B病毒(CoxsackievirusB,CVB)初始受體為CAR,共受體為DAF。
病毒顆粒的內(nèi)化主要是通過網(wǎng)格蛋白依賴、包膜窖介導(dǎo)以及直接與膜融合等方式進(jìn)行。
1.2.1 網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞(clathrin-mediatedendocytosis) 一旦病毒與受體結(jié)合,即在細(xì)胞膜上形成配-受體聚集的有被小窩,繼而內(nèi)陷并脫離細(xì)胞膜形成網(wǎng)格蛋白包被的有被小泡,在解聚酶作用下,融合形成早期內(nèi)含體,逐漸與溶酶體融合。在這一過程中,一般內(nèi)含物會(huì)隨pH值下降而在溶酶體中被降解。但病毒外殼蛋白則會(huì)隨pH值下降發(fā)生構(gòu)象改變,破壞內(nèi)含體膜穩(wěn)定,進(jìn)而進(jìn)入胞漿逃避溶酶體的降解。
胞膜窖介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制主要發(fā)生在極性細(xì)胞中,可能與病毒有無包膜,直徑大小有關(guān)。如猴病毒40(simian virus40,SV40)、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)以及呼吸道病毒(respiratory virus,RSV)都是以胞膜窖介導(dǎo)機(jī)制被內(nèi)吞的[3]。
1.2.3 病毒直接與胞膜融合 有包膜病毒最有效的入胞方式是在中性pH條件下直接與細(xì)胞膜融合,將其基因組DNA或RNA直接送入胞漿[4]。研究表明,HIV-1表面存在的糖蛋白gp120與靶細(xì)胞膜上的初始受體CD4結(jié)合,使病毒包膜蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,促使其招募并進(jìn)一步與共受體CXCR4或CCR5結(jié)合。這種膜與膜之間的相互作用,使暴露出的糖蛋白gp41會(huì)在其中部亮氨酸拉鏈保守序列卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的作用下象彈簧一樣彈入靶細(xì)胞膜中,拉近病毒包膜與細(xì)胞膜的距離,隨之發(fā)生膜融合并將病毒RNA釋放進(jìn)入胞漿。
不同病毒有不同的逃逸策略,比較簡單的逃逸機(jī)制是病毒與細(xì)胞膜表面受體特異性結(jié)合,直接將基因組釋放入胞完成感染;比較復(fù)雜逃逸機(jī)制則是病毒與受體特異性結(jié)合后被內(nèi)吞進(jìn)入內(nèi)含體,再突破內(nèi)含體/溶酶體膜進(jìn)入胞漿。
1.3.1 有包膜病毒的逃逸機(jī)制 病毒包膜融合蛋白分為I型和Ⅱ型融合蛋白,不同融合蛋白以不同機(jī)制與內(nèi)含體膜發(fā)生融合。I型融合蛋白融合前后都是三聚體形式,融合后形成α-螺旋。流感病毒血凝素HA是經(jīng)典的I型融合蛋白,病毒通過HA糖蛋白與唾液酸結(jié)合形成病毒-受體復(fù)合物依賴網(wǎng)格蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞而內(nèi)化,至晚期內(nèi)含體時(shí),低pH值誘導(dǎo)HA蛋白構(gòu)象改變,使無融合活性的母體HA被剪切成HA1和HA2兩種多肽[5]。HA2是一種融合肽,其疏水端與內(nèi)含體膜發(fā)生作用,破壞內(nèi)含體膜的穩(wěn)定性,導(dǎo)致病毒包膜與內(nèi)含體膜融合,將病毒基因注入胞漿。Ⅱ型融合蛋白在融合過程中經(jīng)歷了從二聚體到同源三聚體的轉(zhuǎn)變,同源三聚體的融合蛋白能插入內(nèi)含體膜,形成具有β-折疊的三聚體發(fā)夾結(jié)構(gòu),使病毒基因進(jìn)入胞漿。
1.3.2 不依賴于融合蛋白的內(nèi)含體逃逸機(jī)制 無包膜病毒通過膜裂解或打孔方式將病毒基因組釋放至胞漿。膜裂解方式是陽性電荷沿著磷脂膜表面垂直排列,像地毯一樣將整個(gè)細(xì)胞表面覆蓋,進(jìn)而發(fā)生倒轉(zhuǎn),產(chǎn)生去垢劑樣作用,使膜的穩(wěn)定性被破壞,出現(xiàn)瞬時(shí)高通透性,使其得以內(nèi)化。打孔式是肽成束排列插入細(xì)胞膜中,桶樣結(jié)構(gòu)的孔型通道(疏水性氨基酸)與膜疏水核心相互形成外表面,親水氨基酸形成孔的內(nèi)表面,進(jìn)一步發(fā)生跨膜轉(zhuǎn)位,實(shí)現(xiàn)內(nèi)化。
當(dāng)病毒核心成分進(jìn)入胞漿后,其基因組和相關(guān)蛋白在胞漿中的運(yùn)輸機(jī)制非常復(fù)雜,不同組分會(huì)在其特定信號(hào)作用下,定位于細(xì)胞內(nèi)不同位置發(fā)揮其功能,如作用于DNA或其他與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄有關(guān)因子需要進(jìn)入細(xì)胞核;部分蛋白質(zhì)需要停留在胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用,在胞核、胞漿、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基體,通過一系列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、合成、成熟及運(yùn)轉(zhuǎn)等復(fù)雜過程產(chǎn)生新一代的病毒顆粒。
2 病毒感染機(jī)制對載藥多肽設(shè)計(jì)的啟示
病毒能高效率地進(jìn)入特定細(xì)胞進(jìn)行基因復(fù)制,表達(dá)自身蛋白,產(chǎn)生新的病毒顆粒,因此一些病毒被改造成為基因治療的有效載體。病毒載體雖經(jīng)改造除去了病原性,保留了其高效基因轉(zhuǎn)染特性,但因其安全性隱患、制備復(fù)雜、目的基因容量受限以及免疫原性等問題,限制其推廣應(yīng)用。因此人們對低毒的非病毒載體開發(fā)寄予了厚望。在眾多的非病毒載體中,利用病毒入胞機(jī)制和“元件”設(shè)計(jì)開發(fā)的載藥多肽(包括細(xì)胞膜穿透肽、內(nèi)含體逃逸肽和亞細(xì)胞器定位肽等)更為引人注目。這類多肽可以獨(dú)立,也可以聯(lián)合有機(jī)高分子、脂質(zhì)體等形成高效、安全的仿病毒載體,用以提高基因藥物或基因工程蛋白藥物靶向遞送、轉(zhuǎn)染(導(dǎo))以及胞內(nèi)運(yùn)輸效率
細(xì)胞膜的選擇通透性阻止了絕大多數(shù)大分子物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi),限制了許多必須進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部才能發(fā)揮治療作用的蛋白以及核苷酸等作為藥物的推廣應(yīng)用[6]。細(xì)胞膜穿透肽(cell penetrating peptides,CPPs)是近些年來發(fā)現(xiàn)的,能有效將生物大分子跨膜送入細(xì)胞內(nèi)的一類富含陽離子的短肽。根據(jù)其來源大致可分為兩類,一類是來源于病毒或微生物的天然存在蛋白,如來源于HIV-1tat肽段的TAT、果蠅同源觸角蛋白(drosophila hemeoprotein an-tennapedia transcription protein,ANTP)、I型單純皰疹病毒(herpes simplex Virus type1,HSV-1)蛋白的VP22和乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus,HBV)的PreS2等;另一類為根據(jù)CPPs的特點(diǎn)人為合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-1、MAP、transportan和各種基于不同信號(hào)序列合成的肽段等[7]。CPPs能在體外或體內(nèi)作為載藥多肽,介導(dǎo)一系列生物活性分子如蛋白質(zhì)、多肽、siRNA、DNA甚至納米顆粒等進(jìn)入細(xì)胞,發(fā)揮各自的生物學(xué)效應(yīng)。這類CPPs基本無毒副作用,并不干擾所攜帶生物大分子活性[8]。迄今發(fā)現(xiàn)的CPPs大部分是直接來源于病毒蛋白或由病毒相關(guān)“元件”組合而成的。
2.1.1 TAT TAT(YGRKKRRQRRR)是HIV-1反式轉(zhuǎn)錄因子tat的第48~60位氨基酸殘基片段。Guelen等[9]的研究發(fā)現(xiàn)TAT-VP3能有效誘導(dǎo)成骨肉瘤細(xì)胞Saos-2和人類口腔癌鱗狀細(xì)胞HSC-3凋亡。Liu等[10]將TAT偶合于聚乙二醇-膽固醇載體材料上,形成雙功能靶向載體TAT-PEG-b-Chol,發(fā)現(xiàn)相對于PEG-b-Chol,TAT-PEG-b-Chol能更有效地?cái)y帶納米顆粒穿過血-腦屏障并定位于神經(jīng)細(xì)胞的胞核。Tian等[11]將TAT與dsRNA結(jié)合域(DRBD)形成融合肽后能有效地將siRNA運(yùn)送至胞漿。Eguchi等[12]的研究結(jié)果表明,用TAT-DRBD不僅可以有效將siRNA送入各種培養(yǎng)細(xì)胞株,也能將siRNA送入原代培養(yǎng)細(xì)胞、干細(xì)胞甚至能在個(gè)體水平成功遞送有生物活性的siRNA。TAT可以使得原本不能進(jìn)入細(xì)胞的大分子蛋白、siRNA等高效進(jìn)入細(xì)胞。
2.1.2 MPG MPG是由來源于HIV-1糖蛋白gp41的N端胞膜融合序列和來源于SV40的核定位信號(hào)的一段親水系列通過3個(gè)氨基酸間隔連接而成的27個(gè)氨基酸殘基的CPP。Simeoni等[13]研究發(fā)現(xiàn),MPG可以攜帶寡聚核苷酸,質(zhì)粒DNA,siRNA等進(jìn)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,MPG能介導(dǎo)對貼壁、懸浮細(xì)胞,癌細(xì)胞株或原代細(xì)胞的高效率轉(zhuǎn)染,這是其他非病毒轉(zhuǎn)染方法不能達(dá)到的。Veldhoen等[14]通過改變疏水端6個(gè)氨基酸來修飾MPG制備了MPGα,發(fā)現(xiàn)能與核酸形成非共價(jià)連接的、高度靈活性的復(fù)合物,高效地介導(dǎo)了siRNA轉(zhuǎn)染,有效地下調(diào)了培養(yǎng)細(xì)胞的目的基因表達(dá)。
此外研究者們還嘗試了利用很多病毒“元件”如狂犬病毒胞膜蛋白[16]、骯病毒蛋白[17]等向腫瘤細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞遞送藥物。
研究發(fā)現(xiàn),CPPs及其攜帶生物分子會(huì)被局限在內(nèi)含體等胞內(nèi)囊泡中而影響CPPs介導(dǎo)的遞送效率,CPPs及其攜帶分子能否從內(nèi)含體中逃逸是胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)南匏俨襟E。研究人員在應(yīng)用促滲劑、優(yōu)化跨膜輸送條件[18]的同時(shí)也從病毒的內(nèi)含體逃逸過程中得到啟發(fā)。病毒的逃逸機(jī)制可能與其利用自身具有逃逸功能的某些結(jié)構(gòu)“元件”在低pH值環(huán)境中破壞內(nèi)含體膜有關(guān)。
2.2.1 流感病毒紅細(xì)胞血凝素HA2 Michiue等[19]連接流感病毒HA2、多聚精氨酸(9R)和P53形成融合蛋白,作用于惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn),HA2-P53-9R融合蛋白能更好地抑制腫瘤細(xì)胞生長,誘發(fā)凋亡。wadia等[20]將TAT與HA2構(gòu)成融合多肽,通過觀察TAT-HA2介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)重組酶Cre的酶活性發(fā)現(xiàn),HA2能顯著增強(qiáng)融合蛋白從內(nèi)含體中釋放,使胞內(nèi)Cre活性顯著提高。Sugita等[21]用熒光素標(biāo)記的TAT和/或TAT-HA2作用于細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),TAT單獨(dú)處理細(xì)胞時(shí)熒光主要集中在內(nèi)含體內(nèi),而經(jīng)TAT-HA2共處理后在胞漿觀察到大面積均勻分布的熒光。
2.2.2 人乳頭瘤病毒(HPV)衣殼蛋白L2 Kamper等[22]發(fā)現(xiàn),野生型L2包被的病毒基因組能從細(xì)胞內(nèi)含體中逃逸轉(zhuǎn)移到核內(nèi),而野生型L1單獨(dú)包被的基因組及L2羧基端缺失突變體包被的基因組則不能穿透內(nèi)含體膜進(jìn)入胞漿到達(dá)胞核。提示HPV衣殼蛋白L2羧基端的23個(gè)氨基酸殘基具有內(nèi)含體逃逸功能。將CPPs與L2羧基端短肽融合有可能促進(jìn)CPPs及其攜帶分子從內(nèi)含體逃逸,提高其生物學(xué)活性。
2.2.3 含組氨酸的病毒多肽 分子病毒學(xué)研究發(fā)現(xiàn),很多病毒的內(nèi)含體逃逸與其膜蛋白中的組氨酸有關(guān),在酸性環(huán)境中,組氨酸的存在和暴露會(huì)發(fā)生質(zhì)子化,從而影響內(nèi)含體膜穩(wěn)定性使病毒成分逃逸進(jìn)入胞漿。具有內(nèi)含體逃逸功能的細(xì)胞膜穿透肽EB1就是依據(jù)這種理論設(shè)計(jì)的,以易形成α-螺旋的組氨酸取代了penetratin序列上特定的氨基酸,從而促使其從內(nèi)含體中逃逸。Lundberq等[23]研究發(fā)現(xiàn),EB1可以高效地介導(dǎo)siRNA下調(diào)靶基因表達(dá)。Lo等[24]通過在TAT上偶聯(lián)組氨酸和半胱氨酸發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)其內(nèi)含體逃逸,提高DNA轉(zhuǎn)染效率。
由于CPPs介導(dǎo)的各種生物大分子在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)作用的位置各不相同,一些生物活性分子需在特定細(xì)胞器內(nèi)才能發(fā)揮其功能。因此CPPs及其攜帶分子胞吞釋放后的亞細(xì)胞器定位亦是其可否發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵。前述的MPG,PEP-1在設(shè)計(jì)上都利用了病毒的核定位信號(hào)等“元件”。
2.3.1 靶向細(xì)胞核 MPG具有核定位信號(hào)(NLS)能夠有效地將攜帶DNA等遞送至胞核。MPG△NLS是在MPG基礎(chǔ)上將NLS號(hào)中賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸而失去核定位功能的CPP。報(bào)道稱[25]50nmol.L—1的MPG△NLS非共價(jià)連接siRNA復(fù)合物可以下調(diào)90%~95%熒光素酶活性(Luci-siRNA)及80%內(nèi)源性GAPDH(GAPDH-siRNA)表達(dá)。
2.3.2 靶向線粒體 Zhao等[26]研究發(fā)現(xiàn)了一種選擇性定位于線粒體內(nèi)膜且具有很好的膜穿透功能抗氧化短肽SS-31。在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)加入SS-31能減少細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生,并很好地對抗了叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Sun等[27]發(fā)現(xiàn)了一種8個(gè)精氨酸(R8)肽的衍生物CALN-NR8肽,它可以靶向細(xì)胞核或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。也有報(bào)道稱基于線粒體靶向的寡聚胍鹽所設(shè)計(jì)的穿膜載體成功地將大分子藥物遞送至腫瘤細(xì)胞線粒體中[28]。
3 展望
盡管病毒載體是迄今最有效的生物大分子遞送載體,其安全性等問題嚴(yán)重限制了其在臨床上的推廣應(yīng)用。病毒入胞、內(nèi)含體逃逸等機(jī)制為生物大分子的高效胞內(nèi)輸送提供了很好的思路。研究人員從病毒感染機(jī)制得到的啟發(fā)已經(jīng)在載藥多肽設(shè)計(jì)中得以運(yùn)用,利用這種思路設(shè)計(jì)的CPPs得以逃逸內(nèi)含體,精確地靶向亞細(xì)胞器等,使CPPs能更高效、準(zhǔn)確地向靶細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送各種生物活性分子,以達(dá)到治療及預(yù)防疾病的目的。我們在探究優(yōu)化CPPs穿膜效率的同時(shí),也嘗試了運(yùn)用靶向CPP攜帶抗癌蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[18,29]。隨著分子病毒學(xué)的研究不斷深入,人們對病毒將會(huì)有更深的理解,將來的高效智能、仿病毒載藥工具設(shè)計(jì)將會(huì)自如地避免病毒有害成分,運(yùn)用其有益“元件”,使基因工程蛋白、siRNA、DNA等新一代治療藥物得以推廣應(yīng)用。
免責(zé)聲明：本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí)，版權(quán)歸原作者及原雜志所有，如有侵權(quán)，可聯(lián)系刪除。文章標(biāo)注有作者及文章出處，如需閱讀原文及參考文獻(xiàn)，可查閱中國藥學(xué)雜志2011年12月第46卷第23期
