摘要：創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)影響了超過(guò)317萬(wàn)美國(guó)人。治療TBI后血管破裂引起的出血和凝血對(duì)于患者的康復(fù)至關(guān)重要。腦血管病變?cè)赥BI的潛在機(jī)制中起著重要作用。本研究的目的是評(píng)估一種用于腦損傷后受傷組織的新型再生醫(yī)學(xué)。我們利用最近描述的具有血管生成潛力的合成生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)損傷部位的血管原位生長(zhǎng)。先前的工作已經(jīng)展示了這種可注射的自組裝肽基水凝膠(韋斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院在損傷部位為新生血管形成創(chuàng)造再生微環(huán)境。超分子組裝可實(shí)現(xiàn)觸變性；可注射藥物輸送系統(tǒng)提供持續(xù)體內(nèi)療效。本研究采用中度鈍性損傷模型造成物理性血管損傷和出血。然后將血管生成性SAPH直接應(yīng)用于受傷的大鼠腦。在TBI后第7天，觀察到的血管明顯多于假手術(shù)和損傷對(duì)照組，以及VEGF受體2的激活，表明血管生成性SAPH引發(fā)了強(qiáng)烈的血管生成反應(yīng)。血管標(biāo)志物血管性血友病因子(vWF)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)在血管生成性SAPH的反應(yīng)中表現(xiàn)出與血管密度同時(shí)增加。此外，還檢查了血腦屏障完整性和血液凝固作為指示TBI后傷口恢復(fù)的參數(shù)。通過(guò)NeuN和髓鞘堿性蛋白染色進(jìn)行的神經(jīng)元拯救檢查表明，血管生成SAPH可能在長(zhǎng)期恢復(fù)中提供神經(jīng)保護(hù)益處。
1 介紹
創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)通常由機(jī)械力或突然加速-減速引起[1]僅在2013年，美國(guó)就有約280萬(wàn)人因TBI到急診室就診，其中320萬(wàn)至530萬(wàn)人患有永久性長(zhǎng)期殘疾，近年來(lái)，TBI引起了公眾的廣泛關(guān)注，因?yàn)樵S多與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的腦震蕩損傷和與軍事相關(guān)的鈍性/彌漫性爆炸損傷——這些損傷都被認(rèn)為會(huì)增加慢性創(chuàng)傷性腦病和其他認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)[3]。
TBI由原發(fā)性和繼發(fā)性機(jī)制組成，原發(fā)性損傷是組織的物理?yè)p傷，包括挫傷、血管穿透或軸突拉伸[4，5],繼發(fā)性損傷會(huì)在幾分鐘內(nèi)發(fā)生，并持續(xù)數(shù)年，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退化。TBI的主要問(wèn)題是創(chuàng)傷后早期階段對(duì)腦血管的直接損傷，這種現(xiàn)象在TBI患者中觀察到，并在TBI動(dòng)物模型中重現(xiàn)[7–9]在細(xì)胞水平上，腦血管系統(tǒng)為擴(kuò)張的神經(jīng)血管單元(eNVU)貢獻(xiàn)了幾個(gè)關(guān)鍵組成部分，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞。血管樹(shù)的破壞會(huì)導(dǎo)致缺血、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、代謝物輸送改變、缺氧和組織死亡。此前，我們發(fā)現(xiàn)出血相關(guān)凝血導(dǎo)致鈍性TBI模型中的急性壞死性細(xì)胞死亡[5]，這表明促進(jìn)新血管生成的藥物可能有助于增強(qiáng)TBI的恢復(fù)。
迄今為止，TBI的臨床試驗(yàn)尚未專門(mén)針對(duì)原位血管生成和神經(jīng)生成。腦缺血的臨床前研究充斥著各種治療策略，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、西地那非、阿托伐他汀、氨基甲�；偌t細(xì)胞生成素(EPO)和EPO單一療法等。生長(zhǎng)因子治療也有助于eNVU重塑，改善缺血性腦損傷后的預(yù)后[18]。然而，這些全身或局部治療在幾分鐘到幾小時(shí)內(nèi)就會(huì)被身體清除，并且沒(méi)有持久的局部效果。此外，很少有策略報(bào)告產(chǎn)生支持性原位微環(huán)境以促進(jìn)傷口愈合[19]。
自組裝肽水凝膠(SAPH)是一種在局部組織微環(huán)境中呈現(xiàn)強(qiáng)效生物信號(hào)的簡(jiǎn)便方法。SAPH由化學(xué)合成的寡肽（通常長(zhǎng)5-50個(gè)氨基酸）組成，具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域[20–23]。主要的自組裝結(jié)構(gòu)域（SAPH由此得名）由極性氨基酸殘基組成，這些氨基酸殘基位于交替的親水性和疏水性氨基酸殘基的中間區(qū)兩側(cè)，SAPH可以被設(shè)計(jì)成包含降解序列，例如中間區(qū)中的MMP-2易感-LRG-結(jié)構(gòu)域，以加速體內(nèi)生物降解，此外，當(dāng)SAPH末端被生長(zhǎng)因子的短肽模擬物功能化時(shí)，它可以促進(jìn)細(xì)胞特異性信號(hào)傳導(dǎo)。值得注意的是，SAPH具有附加的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-165)模擬物QK，這種血管生成SAPH被稱為SLanc，它組裝成高密度顯示QK表位的纖維（圖1）（A–C）由于非共價(jià)相互作用，這些肽在針剪切下迅速組裝和分解。
從我們以前的研究中，目前注射SAPH已經(jīng)經(jīng)過(guò)了檢驗(yàn)體外細(xì)胞相容性、血管生成、后肢缺血恢復(fù)以及多種缺血性組織疾病的治療分析。在本研究中，我們?cè)u(píng)估了受傷大鼠腦中稱為 SLanc 的血管生成 SAPH，以了解其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的血管生成和神經(jīng)保護(hù)作用。使用側(cè)向液壓沖擊損傷模型 (FPI) 誘發(fā)中度創(chuàng)傷性腦損傷，伴有物理血管破裂和組織變形 [33]。FPI 后立即將 SLanc 肽水凝膠注射到損傷部位，并在損傷后第 7 天和第 14 天評(píng)估生物分布以及組織學(xué)恢復(fù)（血管生成和神經(jīng)元存活率）。
2 材料和方法
2.1 肽的合成與表征
SLanc 的制備方法如上所述 [25,27]。簡(jiǎn)而言之，SLanc 采用標(biāo)準(zhǔn) Fmoc 固相肽合成方案合成，并通過(guò)對(duì)去離子水透析2天進(jìn)行純化（見(jiàn)表 1)用于肽序列）。將透析的肽冷凍、凍干并以粉末形式儲(chǔ)存在−80°C下直至配制。肽水凝膠最初以20mg/ml（2 w. %）的濃度在無(wú)菌298 mM蔗糖中制備，pH值調(diào)節(jié)至7。為了獲得10 mg/ml的最終濃度，加入與蔗糖相同體積的無(wú)菌1X HBSS。該制劑可輕松用25G針頭注射。
2.3 動(dòng)物處理
成年雄性和懷孕雌性 Sprague-Dawley 或 Wistar 大鼠購(gòu)自 Charles River Laboratory（馬薩諸塞州威爾明頓）。動(dòng)物飼養(yǎng)在室溫條件下，在 12 小時(shí)暗光循環(huán)下自由進(jìn)食和飲水。該方案經(jīng) NJIT-Rutgers-Newark 機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南》中的指導(dǎo)原則。
2.4 皮下植入
將 1% (w/v) SLanc 注射到 200–225 克 Wistar 大鼠背部皮下空間，以評(píng)估正常生理反應(yīng)體內(nèi). 注射了 200 μL SLanc（n = 3），第 7 天取出組織，并準(zhǔn)備進(jìn)行免疫熒光染色。
2.5 流體沖擊損傷（FPI)
隨機(jī)選取 Sprague Dawley 雄性大鼠（250-300 克；8-11 周齡）進(jìn)行側(cè)位 FPI 治療，以造成中度 TBI [34]。假手術(shù)損傷病例作為對(duì)照。每組使用 5 只大鼠（假手術(shù)、FPI+PBS、FPI+SLanc）。所有大鼠均用氯胺酮（100 mg/kg）混合物麻醉，并通過(guò)腹膜內(nèi)注射給予賽拉嗪（10 mg/kg）并放置在立體定位框架中。在左頂骨上進(jìn)行開(kāi)顱（3.0 mm），距離中線外側(cè) 2.5 mm 和距離前囟尾部 3.0 mm，硬腦膜完好無(wú)損。將 Luer-lock 中心安裝在開(kāi)顱窗上，并用氰基丙烯酸酯凝膠固定在頭骨上。通過(guò)使用甲基丙烯酸甲酯（Henry Schein，Melville，NY，USA）密封中心。一旦甲基丙烯酸甲酯變硬，Luer-lock 就會(huì)充滿無(wú)菌鹽水。手術(shù)后一天，將動(dòng)物隨機(jī)分配接受假手術(shù)或 FPI。假手術(shù)動(dòng)物接受了除誘發(fā)損傷之外的所有手術(shù)程序。為了誘發(fā) FPI，將擺錘釋放到充滿液體的氣缸的活塞上以誘發(fā)損傷。中等 FPI（1.6-1.8 個(gè)大氣壓）后記錄的呼吸暫停和翻正反射時(shí)間分別為 10-12 秒和 6-8 分鐘。
2.6 F-SLanc 的治療干預(yù)和生物分布
FPI 和麻醉后，將大鼠置于立體定位框架中，用 5 μl SLanc 肽水凝膠、熒光標(biāo)記的 SLanc 肽或 PBS 進(jìn)行治療，作為損傷對(duì)照。根據(jù)立體定位坐標(biāo)的注射位置為：AP = −3，L = 距 Bregma −2.5，背腹 (DV) = 0.5 毫米。然后移除損傷中心，縫合頭部。大鼠在加熱墊上恢復(fù)，然后被送回籠子。
2.7 腦池內(nèi)腦脊液示蹤劑輸注
將熒光 FITC 示蹤劑（葡聚糖，熒光素，2,000,000 MW，（Thermo Fisher）在人工腦脊液（5 mg/ml）中重構(gòu)，通過(guò)小腦延髓池注入麻醉大鼠體內(nèi)[三十五]，處死前 2 小時(shí)。該既定方案用于追蹤血管損傷，因?yàn)檫@種大分子示蹤劑沿血管周?chē)臻g分布 [5].用注射泵（Harvard Apparatus）通過(guò)30號(hào)針頭將10 μL FITC示蹤劑以1 μl/min的速率輸注到麻醉大鼠體內(nèi)，持續(xù)10分鐘。
2.8 組織處理
FPI/FPI + 治療后 3、7、14 天，通過(guò)緩慢經(jīng)心臟灌注冰冷磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 來(lái)對(duì)大鼠實(shí)施安樂(lè)死，隨后再用冰冷的 4% 多聚甲醛 (PBS) 進(jìn)行灌注。將大腦浸泡在 4% 多聚甲醛中過(guò)夜，隨后在 PBS 中的 30% 蔗糖中進(jìn)行冷凍保護(hù)。從每個(gè)樣本中處理 20 μm 厚的冠狀切片，并儲(chǔ)存在 −80 °C 下以供進(jìn)一步分析。
2.9 免疫熒光和顯微鏡
用 PBS 清洗腦組織切片，在 -20 °C 下用丙酮-甲醇（體積比 1:1）固定 10 分鐘，進(jìn)行免疫熒光染色。然后用 3% 牛血清白蛋白在 25 °C 下封閉固定的載玻片 1 小時(shí)，并加入 0.1% Triton X-100。將載玻片與圖 1 中所示的一抗一起孵育(表 2), 4°C 下過(guò)夜以探測(cè)相應(yīng)的抗原。用 PBS 清洗樣品載玻片，然后與抗小鼠/山羊/兔/綿羊免疫球蛋白-G (IgG) 結(jié)合的 Alexa Fluor 488/594 孵育 1 小時(shí)。用 PBS 清洗后，將樣品載玻片安裝在含有 DAPI (Thermo Fisher) 的免疫支架上。用 Leica Aperio Versa 200 數(shù)字病理級(jí)載玻片掃描儀掃描 (20 倍放大倍數(shù)) 全腦組織切片圖像，并用熒光顯微鏡 (IX81 DSO；Olympus，新澤西州薩默塞特) 捕獲詳細(xì)的區(qū)域熒光圖像。
2.10 蛋白質(zhì)印跡法
使用超聲處理將新鮮腦組織與 CellLytic-M (Sigma) 裂解緩沖液（每 10 毫克組織 500 μL 緩沖液）在冰上均質(zhì)化。在冰上孵育 30 分鐘后，在 4 °C 下以 13,000 rpm 的速度離心該均質(zhì)物 20 分鐘，收集上清液并通過(guò)二辛可寧酸 (BCA) 方法（Thermo Fisher）評(píng)估蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)以 20 μg/泳道加入 4–15% SDS-PAGE 梯度凝膠（Thermo Fisher）中，轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，用 5% 牛奶封閉，在 4 °C 下與一抗孵育過(guò)夜，洗滌，并在室溫下與相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗（1:10000 稀釋）孵育 1 小時(shí)。通過(guò) West Pico 化學(xué)發(fā)光底物（Thermo Fisher）檢測(cè)免疫反應(yīng)帶。使用 ImageJ 軟件將數(shù)據(jù)量化為密度強(qiáng)度。
3 結(jié)果
3.1 血管生成肽水凝膠特性
如前所述，SLanc是通過(guò)常規(guī)Fmoc固相肽合成法合成的，并通過(guò)透析和HPLC純化。肽在水性緩沖液中通過(guò)同時(shí)形成氫鍵和疏水填充自組裝成納米纖維水凝膠（圖1A–C)。我們?cè)u(píng)估了SLanc的自組裝、細(xì)胞相容性和血管生成潛力體外和體內(nèi)（皮下和嚙齒動(dòng)物后肢缺血模型）,從我們之前的細(xì)胞相容性試驗(yàn)來(lái)看體外，SLanc增加人類間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞粘附并促進(jìn)內(nèi)皮劃痕試驗(yàn)中的傷口愈合[25]。在本研究中，我們嚴(yán)格分析了這種簡(jiǎn)便策略在創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后傷口恢復(fù)中的有效性。與這項(xiàng)工作相關(guān)的是，SLanc與大鼠原代神經(jīng)元的細(xì)胞相容性表明在SLanc水凝膠中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)突生長(zhǎng)，圖1D.進(jìn)行SLanc皮下植入以研究血管生成（圖S1)，在對(duì)大鼠TBI模型進(jìn)行評(píng)估之前，圖1E.內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的免疫染色圖像顯示治療后第7天和第14天皮下具有強(qiáng)大的血管生成作用（圖S1重要的是，在測(cè)試的濃度范圍內(nèi)，在任何培養(yǎng)物中均未觀察到水凝膠的細(xì)胞毒性：在這些研究和之前的研究中，0.1w%溶液-1w%水凝膠適用于一系列細(xì)胞類型[25，27]。
3.2 血管生成水凝膠可增加受傷大腦的血管密度
為了檢查肽水凝膠在撞擊部位的生物分布，在損傷部位進(jìn)行 FPI 后直接將熒光標(biāo)記的 SLanc 注射到顱內(nèi)。注射后，肽水凝膠表現(xiàn)出觸變性剪切稀化，并幾乎瞬間恢復(fù)成原位水凝膠，注射后 1 周內(nèi)大部分凝膠仍停留在局部（圖 2A)。治療后第 14 天，植入的水凝膠表現(xiàn)出預(yù)期的適度生物降解，部分分布在皮質(zhì)、海馬體，部分分布在腦室。使用肽水凝膠的意義在于在損傷部位形成持久的藥物表位呈遞庫(kù)，用于治療性血管生成，隨后降解。SLanc 在 CNS 中的持久性可達(dá) 14 天，與之前報(bào)道的皮下和肌肉內(nèi)持久性相當(dāng) [27]。
創(chuàng)傷性腦損傷后，蘇木精和伊紅 (H&E) 染色的切片清晰顯示細(xì)胞浸潤(rùn)和血管生成（圖 2B–E)，在 SLanc 治療的損傷中（圖 2D）與傷害控制大腦（圖 2C）和假（圖 2B). 損傷對(duì)照組中觀察到血管痙攣，血管周?chē)g隙擴(kuò)大圖 2C. FPI 后 7 天，在水凝膠植入物附近捕捉到的放大圖形（圖 2E) 顯示清晰的血管生成和增加的細(xì)胞浸潤(rùn)，表明血管生成 SAPH 促進(jìn)血管再生。
3.3 TBI 后 SAPH 治療可促進(jìn)血管生成
VEGF受體2有望在受傷的大腦中被激活以實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)，在腦損傷的血管生成和神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用。三十六–三十九因此，通過(guò) VEGF 受體 2 表達(dá)來(lái)評(píng)估血管生成過(guò)程的機(jī)制理解以及新血管的識(shí)別（圖 3）。研究發(fā)現(xiàn)，SLanc 治療導(dǎo)致?lián)p傷后第 7 天 VEGFR2 表達(dá)顯著增加（圖 3C)，與損傷對(duì)照和假腦相比（圖 3A–B）。對(duì)應(yīng)于組織學(xué)染色中血管數(shù)量的增加（圖 2E)，在血管結(jié)構(gòu)中特異性地觀察到陽(yáng)性免疫活性（圖 3D)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡定量分析，我們還注意到 FPI 損傷大腦中 VEGFR2 上調(diào)，這是修復(fù)受損血管的天然反應(yīng)，但我們的血管生成肽顯著上調(diào) VEGFR2，以促進(jìn)血管生成，而不是天然傷口愈合過(guò)程（圖 3E).
血管形成的關(guān)鍵是其新生/成熟度、通透性和治療性再血管化缺血組織的能力。這是通過(guò)使用血管性血友病因子 (vWF) 和成熟小動(dòng)脈/小靜脈標(biāo)記平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物 (α-平滑肌肌動(dòng)蛋白) 對(duì)新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行染色觀察到的。圖 4. 在 TBI 后第 7 天，在 FPI 損傷腦內(nèi)及其周?chē)^察到 SLanc 水凝膠植入物內(nèi)和周?chē)鷥?nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增加（圖 4A–B）。vWF 的蛋白質(zhì)印跡顯示，與損傷對(duì)照和假手術(shù)相比，F(xiàn)PI+SLanc 腦中內(nèi)皮細(xì)胞的募集明顯增多（圖 4C). 與假手術(shù)相比，F(xiàn)PI+PBS 和 FPI+SLanc 在圖 4D，我們觀察到損傷控制中血管結(jié)構(gòu)的破壞明顯增多。SLanc 治療導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞襯里浸潤(rùn)明顯增多，表明成熟穩(wěn)定的血管正在發(fā)育。
3.4 血管生成 SAPH 具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用并減少軸突損傷
有人推測(cè)，SLanc 治療促進(jìn)的治療性血管生成可能轉(zhuǎn)化為損傷腦中神經(jīng)元存活率的提高。以前的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PI 后凝血顯著增加并沿血管積聚，導(dǎo)致血栓性壞死 [5]。在這里，將大分子 FITC-葡聚糖示蹤劑 (2000 kDa) 注入腦脊液 (CSF)（沿血管分布），以追蹤血管損傷作為損傷恢復(fù)的參數(shù)。FITC 示蹤劑與緊密連接蛋白 Zonula occludens (ZO-1) 的共定位進(jìn)一步表明血腦屏障 (BBB) 恢復(fù)是功能恢復(fù)的參數(shù)。在受傷后第 7 天，F(xiàn)ITC 示蹤劑在 FPI 損傷腦中受損的 BBB 中的生物分布被阻斷（圖 5B)，而假手術(shù)動(dòng)物的 BBB 完整且示蹤劑分布均勻。圖 5C 表明 SLanc 修復(fù)了血腦屏障 (BBB) 并恢復(fù)了示蹤劑在腦脊液通路中的分布。此外，在 FPI 后 7 天，血管生成肽 SLanc 發(fā)現(xiàn)受損大腦中的凝血顯著減少，在蛋白質(zhì)印跡定量分析中 (圖 5D).
過(guò)去十年來(lái)，SAPH 已在許多臨床前應(yīng)用中得到應(yīng)用[21–23，27–31，40–42]，血管生成 SAPH 先前已證明對(duì)人類內(nèi)皮細(xì)胞具有血管生成潛力，可促進(jìn)皮下植入物快速血管化，并在后肢缺血模型中快速恢復(fù) [21，25,27]。由于血管損傷和神經(jīng)元丟失，eNVU 中斷使受傷的大腦變得更加復(fù)雜。進(jìn)一步推動(dòng)治療發(fā)展的緊迫性的是缺乏成功的臨床治療方式[43腦血管修復(fù)和血管生成是 TBI 治療中經(jīng)常被低估的一個(gè)方面；關(guān)鍵的里程碑集中在全生長(zhǎng)因子療法、血管擴(kuò)張劑、他汀類藥物和紅細(xì)胞生成促進(jìn)劑上[38，44-46]。在目前的研究中，我們使用了一種自組裝肽基可注射水凝膠 (SLanc)，其中含有可促進(jìn)血管生成的 VEGF-165 模擬物。水凝膠可以在 FPI 后注射到損傷部位，并為 eNVU 的再生提供一致的愈合微環(huán)境。我們的結(jié)果表明，通過(guò)在水凝膠植入物中使用 SAPH 持續(xù)呈現(xiàn) VEGF 模擬物可以引導(dǎo)原生腦 ECM 損傷后的軸突投射和血管生成。內(nèi)皮和平滑肌的組織學(xué)染色和免疫染色表明血管生成 SAPH 誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的血管生成反應(yīng)。此外，發(fā)現(xiàn)潛在機(jī)制是 VEGF 受體 2 的激活和上調(diào)。這伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和 VEGF-R2 的顯著增加。重要的是，已證實(shí) VEGF-R2 可直接激活神經(jīng)元胞內(nèi)信號(hào)通路，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，根據(jù) PI3-K/Akt 通路以及 MAPK ERK 激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路[47],此外，在缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭�，VEGF的過(guò)度表達(dá)被證明可以通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)遷移來(lái)減少梗塞體積。[48]這些支持性研究為血管生成SAPH具有神經(jīng)保護(hù)作用提供了潛在的解釋。
液壓沖擊損傷(FPI)是一種成熟的TBI損傷模型，其損傷類型為混合損傷，包括撞擊部位的局灶性和彌漫性損傷。臨床TBI報(bào)告和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭薪?jīng)常報(bào)道軸突損傷[49研究證明，針對(duì)血管生成也可以誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生，從而改善認(rèn)知障礙。[37，45，46]。我們發(fā)現(xiàn)，在損傷和治療后7天，SLancSAPH激活了血管生成，隨后清除了凝血，修復(fù)了血腦屏障，恢復(fù)了腦脊液通路。這些都導(dǎo)致基于先前確定的損傷機(jī)制的神經(jīng)元丟失的改善[5]。我們進(jìn)一步檢查了受傷和治療后第14天的神經(jīng)元存活率和髓鞘軸突恢復(fù)情況。我們注意到，隨著神經(jīng)血管單元的修復(fù)，與損傷對(duì)照組相比，存活的神經(jīng)元更多。此外，在血管生成SAPH周?chē)^察到神經(jīng)突生長(zhǎng)，表明SLanc具有長(zhǎng)期神經(jīng)保護(hù)作用。
在此，我們認(rèn)為持續(xù)和長(zhǎng)期局部呈現(xiàn)血管生成部分可以幫助保護(hù)神經(jīng)功能并增強(qiáng)愈合。雖然許多血管生成藥物也有類似的用途（例如半衰期較短的西地那非、阿托伐他汀和EPO體內(nèi))，它們的短暫作用不會(huì)帶來(lái)功能/持久的好處。相反，傷口愈合后過(guò)多或持續(xù)的血管生成可能會(huì)導(dǎo)致腦水腫或潛在的出血。雖然SLanc促進(jìn)的血管內(nèi)襯有內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞（表明它們的成熟度和穩(wěn)定性），但受控和可定制的血管生成（按需）將是首選模式。為此，未來(lái)的研究將調(diào)查中樞神經(jīng)系統(tǒng)（以及可能的肽序列）中的不同濃度，以了解恢復(fù)腦血管系統(tǒng)的時(shí)間和功能益處，以及這可能與TBI后的行為結(jié)果有何關(guān)系。
5 結(jié)論和未來(lái)方向
在本研究中，我們研究了受傷腦組織中的血管生成SAPH。可注射自組裝肽水凝膠(SAPH)具有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子模擬物，可在損傷部位提供持續(xù)的血管生成信號(hào)，同時(shí)為組織浸潤(rùn)和再生提供基質(zhì)。通過(guò)免疫組織化學(xué)和血管和VEGF受體2的生物標(biāo)志物進(jìn)一步驗(yàn)證了血管生成。血管生成SAPH被證明可通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞粘附和VEGF-R2上調(diào)來(lái)激活血管生成。在血管生成SAPH內(nèi)和周?chē)^察到神經(jīng)保護(hù)和軸突生長(zhǎng)，表明神經(jīng)血管單元的修復(fù)與神經(jīng)元存活率增強(qiáng)有關(guān)。本研究確立了SAPH在受傷腦部使用的臨床前潛力。追蹤大型動(dòng)物模型中的功能恢復(fù)和行為結(jié)果的長(zhǎng)期研究肯定會(huì)在人體轉(zhuǎn)化之前證明其有效性�？傮w而言，血管生成SAPH可能為神經(jīng)保護(hù)、潛在神經(jīng)元再生和各種其他（神經(jīng)）缺血性組織疾病創(chuàng)造再生環(huán)境。
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