摘要：免疫微環(huán)境在骨缺損修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用。為了創(chuàng)造促進(jìn)成骨的免疫微環(huán)境，研究人員正在探索增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞分化的方法。功能性肽已被發(fā)現(xiàn)可以有效改善這一過(guò)程，但它們受到效率低和降解速度快的限制體內(nèi)。為了克服這些問(wèn)題，設(shè)計(jì)了具有M2調(diào)節(jié)和自組裝模塊的肽作為構(gòu)建超聲響應(yīng)納米纖維水凝膠的構(gòu)建塊。這些納米纖維可以在超聲刺激下以時(shí)間依賴性的方式從水凝膠中釋放出來(lái)，激活線粒體的糖酵解代謝和三羧酸循環(huán)，抑制活性氧的產(chǎn)生并增強(qiáng) M2 巨噬細(xì)胞的極化。該水凝膠通過(guò)觸發(fā) M2 巨噬細(xì)胞分泌 BMP-2 和 IGF-I，加速骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs) 向成骨細(xì)胞的分化，展現(xiàn)出用于骨再生的先進(jìn)治療潛力。因此，模塊化設(shè)計(jì)的仿生超短肽納米纖維水凝膠為重建骨修復(fù)的成骨免疫微環(huán)境提供了一種新策略。
1 介紹
實(shí)現(xiàn)理想的骨缺損修復(fù)對(duì)于創(chuàng)傷、腫瘤切除、萎縮性骨不連等患者而言仍然是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。[1] 骨缺損的再生微環(huán)境依賴于干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix, ECM）、分泌的生物活性因子[2]，其相互作用形成骨特異性微環(huán)境[3]，隨著骨免疫學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明，骨再生過(guò)程并非簡(jiǎn)單的骨形成和骨吸收過(guò)程，而是多個(gè)系統(tǒng)密切相互作用的結(jié)果，包括骨骼系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等[4] 免疫細(xì)胞分泌因子來(lái)建立調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化的微環(huán)境[5]，在骨形成和骨吸收中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有顯著的靈活性，可以根據(jù)微環(huán)境中存在的分子介質(zhì)轉(zhuǎn)化為促炎性 M1 巨噬細(xì)胞或修復(fù)性 M2 巨噬細(xì)胞 [6]，M2型巨噬細(xì)胞最終通過(guò)釋放旁分泌細(xì)胞因子如BMP2、TGF-β、IGF-I和外泌體發(fā)揮重要的抗炎調(diào)節(jié)作用，分泌細(xì)胞因子促進(jìn)干細(xì)胞分化和組織再生[7]，因此，調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化建立有利于損傷修復(fù)的免疫微環(huán)境已成為骨再生領(lǐng)域的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。
目前用于調(diào)控M2巨噬細(xì)胞極化的方法主要包括生物活性劑、免疫調(diào)節(jié)劑和趨化因子[7b-d]，盡管如此，巨噬細(xì)胞的持續(xù)調(diào)節(jié)對(duì)于骨缺損修復(fù)至關(guān)重要，但由于缺乏可以長(zhǎng)期使用的安全有效的功能分子以及難以實(shí)現(xiàn)控制的局部釋放，這一目標(biāo)尚未實(shí)現(xiàn)。[4a–8 ]。因此，迫切需要尋找新的功能策略，有效調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞極化，從而改變免疫微環(huán)境，刺激骨再生。與其他生物分子相比，超短肽具有更優(yōu)越的生物功能、更高的安全性和更低的合成成本[9]。然而，天然肽可能并不總是適合作為治療劑，因?yàn)樗鼈兙哂泄逃械娜觞c(diǎn)，例如半衰期短、物理化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定和水解迅速。因此，開(kāi)發(fā)具有臨床轉(zhuǎn)化潛力的免疫調(diào)節(jié)肽，包括優(yōu)異的藥物形成能力、抗降解性能和生物安全性，至關(guān)重要。不超過(guò)八個(gè)的寡肽通常被稱為超短肽，最近受到廣泛關(guān)注。因此，我們的目標(biāo)是開(kāi)發(fā)一種能夠調(diào)節(jié)骨缺損免疫微環(huán)境的超短肽系統(tǒng)，以加速成骨并促進(jìn)骨損傷再生。
近年來(lái)，生物活性材料作為功能分子引起了廣泛關(guān)注，并逐漸被用于生物醫(yī)學(xué)用途，包括治療免疫缺陷相關(guān)疾病、加速間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化、改善組織血管化、促進(jìn)神經(jīng)再生等[10]，本研究設(shè)計(jì)了一種具有促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化及BMSC分化能力的超短肽(Ser-Glu-Ser-Ser-Glu,SESSE) (方案 1 ）以增強(qiáng)體內(nèi)穩(wěn)定性，我們模塊化設(shè)計(jì)了 SESSE 肽，具有組裝模塊（CFF，黃色）和 M2 極化模塊（SESSE，綠色），可以自組裝成納米纖維。此外，我們合成了超聲響應(yīng)水凝膠就地采用自組裝超短肽納米纖維（記為UPN@水凝膠）修復(fù)骨損傷引起的三維空間缺損。超聲引發(fā)的水凝膠是由海藻酸鹽的羧基與鈣離子配位形成的[11]，超聲處理破壞了鈣離子與羧基之間的配位，導(dǎo)致水凝膠降解，從而促進(jìn)了封裝納米纖維的釋放[12]。同時(shí)，UPN@水凝膠作為穩(wěn)定、可變形的三維支架填充骨缺損區(qū)域，通過(guò)活性超短肽納米纖維的控制釋放，增強(qiáng)成骨免疫微環(huán)境，促進(jìn)骨修復(fù)，為臨床骨缺損修復(fù)提供一種新策略。
首先，通過(guò) CFF-SESSE 自組裝制備肽納米纖維，如圖所示方案 1. 如圖所示圖 1
在 SEM（掃描電子顯微鏡）圖像中觀察到交聯(lián)納米纖維網(wǎng)絡(luò)。然后，合成了海藻酸鈣水凝膠就地與納米纖維一起制成UPN@水凝膠。為了驗(yàn)證此類(lèi)肽納米纖維水凝膠的成功合成，提前制作了FITC標(biāo)記的肽納米纖維。如圖所示圖 1B 中觀察到綠色熒光的均勻分布，證實(shí)了肽納米纖維在水凝膠內(nèi)的均勻分布。此外，F(xiàn)ITR 結(jié)果（圖 S1) 的吸收峰從 1495.5 cm−1移到了 1485.8 cm−1，表明海藻酸鹽的羧基與鈣離子發(fā)生了配位，從而驗(yàn)證了海藻酸鈣水凝膠的形成[13].同時(shí)，肽納米纖維在水凝膠中的負(fù)載效率和負(fù)載量分別為45.2±1.4%和10.5±0.5%（圖 S2)。此外，還應(yīng)用流變學(xué)分析來(lái)確認(rèn)水凝膠的流變性能，結(jié)果顯示儲(chǔ)能模量 (G') 和損耗模量 (G”) 值都很高，表明堅(jiān)硬的水凝膠適合用于骨缺損填充 (圖 S3）并測(cè)量了不同含量肽納米纖維水凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖 S4)，表明負(fù)載肽納米纖維的水凝膠的抗壓強(qiáng)度與海藻酸鈣水凝膠相比較弱，也適合填充骨缺損部位。
2.2 評(píng)估 UPN@水凝膠的超聲響應(yīng)性
首先研究了不同超聲強(qiáng)度下水凝膠的降解行為。此外，還觀察到超聲引發(fā)UPN@水凝膠的加速釋放，如圖所示圖 1C. 終止超聲刺激后，水凝膠繼續(xù)持續(xù)釋放肽納米纖維。此外，將UPN@水凝膠 浸入PBS溶液（pH 6.0和7.4）中以模擬骨缺損區(qū)域的酸性微環(huán)境，超聲反應(yīng)仍然加速水凝膠重量的損失（圖1D和E）。此外，還應(yīng)用了各種超聲波參數(shù)：不進(jìn)行超聲處理、1 W/cm2、1.75 W/cm2和 2.5 W/cm2超聲處理 2 分鐘。結(jié)果表明，隨著超聲強(qiáng)度的增加，水凝膠的降解速度也加快（圖S5）同樣，在施加超聲波后觀察到了更多的 UPN@水凝膠 空腔（圖1F和G)。此外，含有和不含胰蛋白酶的水凝膠之間沒(méi)有顯著差異，表明對(duì)胰蛋白酶具有所需的穩(wěn)定性（圖 S6）。除了體外學(xué)習(xí)，體內(nèi)水凝膠在骨缺損中的降解動(dòng)力學(xué)（圖 1我）或與（圖 1J) 還通過(guò)全身熒光成像研究了超聲，定量表明超聲響應(yīng)加速了水凝膠的降解（圖 1（H）。
2.3 UPN 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞線粒體代謝和氧化應(yīng)激
首次利用免疫熒光法研究了巨噬細(xì)胞對(duì)超短肽納米纖維的吞噬作用，結(jié)果表明，UPN在6 h時(shí)開(kāi)始被巨噬細(xì)胞吞噬，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)和UPN刺激濃度的增加，UPN被巨噬細(xì)胞吞噬的現(xiàn)象日益明顯（圖 2A).然而，超短肽納米纖維并沒(méi)有被BMSCs明顯吞噬（圖 2B). 線粒體代謝是巨噬細(xì)胞功能轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵控制器，并決定其極化狀態(tài)[14]。巨噬細(xì)胞代謝組學(xué)分析顯示，與UPN培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞與糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）密切相關(guān)，提示UPN可以激活巨噬細(xì)胞的糖酵解和三羧酸循環(huán)（圖 2C–E）。TCA循環(huán)中琥珀酸的定量分析表明UPN抑制了琥珀酸代謝（圖 2F). 同時(shí)，對(duì)EMP代謝中乳酸和葡萄糖-6磷酸的定量分析表明，UPN降低了乳酸的產(chǎn)生（圖 2G) 和巨噬細(xì)胞中的葡萄糖 6 磷酸 (圖 2H).透射電鏡檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)，結(jié)果顯示UPNs誘導(dǎo)線粒體的形態(tài)由原來(lái)的棒球狀變?yōu)榕蛎浀臋E圓形（圖 2I).將UPs和UPN孵育巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，UPN組細(xì)胞線粒體腫脹比例為53%，UP組細(xì)胞線粒體腫脹比例為38%，Ctrl組細(xì)胞線粒體腫脹比例接近20%，且UPN組細(xì)胞線粒體腫脹比例較Ctrl組進(jìn)一步增加（圖 2J).此外，線粒體/細(xì)胞比例結(jié)果顯示，UPN組與Ctrl組相比比例進(jìn)一步升高(圖 2K)。通過(guò)線粒體膜電位和活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)釋放分析UPN對(duì)巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響。用JC-1檢測(cè)線粒體膜電位JC-1。免疫熒光結(jié)果顯示UPN可使JC-1聚合物的表達(dá)量由對(duì)照組的0.02熒光強(qiáng)度增至UPN組的0.13(圖 2LM)。ATP檢測(cè)顯示，UPNs促進(jìn)了巨噬細(xì)胞線粒體三羧酸循環(huán)，表明巨噬細(xì)胞能量代謝被激活(圖 2N). 流式細(xì)胞術(shù)分析中，巨噬細(xì)胞內(nèi)總ROS用DCGH-DA標(biāo)記（圖 2O)，并用 MitoSox (圖 2P)。結(jié)果表明，UPN 不僅能夠降低巨噬細(xì)胞中總 ROS 的釋放，而且還能夠降低巨噬細(xì)胞線粒體中 ROS 的釋放（圖 2QR)。總之，UPN可以調(diào)節(jié)線粒體代謝，增強(qiáng)MMP活性，減少ROS釋放。
據(jù)報(bào)道，M1促炎巨噬細(xì)胞和M2修復(fù)巨噬細(xì)胞會(huì)影響損傷后的組織再生。15]。Arg1、CD206和CD163是M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)的基因。對(duì)用UPs治療14天的小鼠骨缺損進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄測(cè)序分析顯示，Arg1和CD163的表達(dá)顯著增加（圖3A).用超短肽納米纖維水凝膠（記為US+UPN@hydrogel）在骨缺損區(qū)域進(jìn)行14天的超聲處理后，M2型巨噬細(xì)胞被F4/80和CD206標(biāo)記（圖3B和C）。流式細(xì)胞術(shù)顯示CD206標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量占巨噬細(xì)胞總數(shù)的百分比增加（圖3D)，而CD86標(biāo)記的M1型巨噬細(xì)胞無(wú)明顯差異（圖3E).免疫熒光結(jié)果顯示US+UPN@hydrogel能夠增加骨缺損處CD206的表達(dá)(圖3F).為了揭示仿生肽納米纖維與巨噬細(xì)胞之間的相互作用，我們將IL-4與BMDM一起孵育，以研究M2型巨噬細(xì)胞的極化體外免疫熒光顯示，UPN能夠進(jìn)一步促進(jìn)IL-4介導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg1和CD206的表達(dá)（圖3G–I).流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD163和CD206的表達(dá)（圖3J和K)，結(jié)果顯示，IL-4+UPN組CD163表達(dá)率為70.6%，IL-4組為50.3%，Ctrl組約為17.2%（圖3L)，IL-4+UPN組CD206表達(dá)率為61.8%，IL-4組為40.9%，Ctrl組約為18.1%（圖3M).RT-qPCR結(jié)果表明UPNs顯著增加了Arg1和CD206的表達(dá)(圖3同樣，Western印跡結(jié)果顯示UPNs明顯促進(jìn)Arg1和CD206蛋白表達(dá)（圖3P).綜上所述,本研究提示UPN@水凝膠治療后骨缺損修復(fù)過(guò)程中,M2修復(fù)巨噬細(xì)胞起主導(dǎo)作用,而超聲觸發(fā)進(jìn)一步促進(jìn)了M2型巨噬細(xì)胞的極化。
2.5 通過(guò)upn調(diào)控STAT6/PPAR-γ/SOCS3軸誘導(dǎo)m2型巨噬細(xì)胞的極化
研究團(tuán)隊(duì)的初步研究結(jié)果顯示，小鼠骨缺損部位通過(guò)尾靜脈注射UPs 14天進(jìn)行治療，通過(guò)基因本體論分析、京都基因與基因組百科全書(shū)分析和基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，UPs與JAK/STAT信號(hào)通路密切相關(guān)（圖 4A–C). 為證實(shí)UPN誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制，我們用IL-4和UPN誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞24小時(shí)，與Ctrl組相比，其p-STAT6熒光強(qiáng)度顯著增加（圖 4D).半定量分析顯示，IL-4+UPN組（13.5%）加入U(xiǎn)PN后，p-STAT6熒光強(qiáng)度較IL-4組（7.8%）和Ctrl組（1.7%）明顯增強(qiáng)（圖 4E).Western blotting結(jié)果證實(shí)，在M2型巨噬細(xì)胞中加入U(xiǎn)PN后，p-STAT6和PPAR-γ蛋白水平上升，SOCS3蛋白水平下降，提示UPN通過(guò)增強(qiáng)STAT6和PPAR-γ蛋白進(jìn)一步促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，而UPN介導(dǎo)SOCS3蛋白下降，從而促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化（圖 4F）IL-4+UPN組p-STAT6和PPAR-γ蛋白濃度明顯升高，SOCS3蛋白濃度明顯降低，而UPN組與Ctrl組之間SOCS3、p-STAT6和PPAR-γ表達(dá)無(wú)明顯差異。以上結(jié)果提示UPN通過(guò)STAT6/PPAR-γ/SOCS3信號(hào)軸進(jìn)一步誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化（圖 4F).流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，GW9662（PPAR-γ抑制劑）抑制了UPN誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的表達(dá)（圖 4G).流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示STAT6-IN-1（STAT6抑制劑）抑制UPN誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的表達(dá)（圖 4（H）。
BMSCs 是能夠修復(fù)骨損傷的種子細(xì)胞 [16] 研究表明，巨噬細(xì)胞由促炎性M1亞型向抗炎性M2亞型的轉(zhuǎn)變?cè)诠菗p傷修復(fù)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)榫奘杉?xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)干細(xì)胞的募集、增殖和分化有顯著的影響。[17]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證M2巨噬細(xì)胞旁分泌生長(zhǎng)因子是否影響B(tài)MSC的行為和命運(yùn)，我們使用共培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)評(píng)估BMDM和BMSC之間的相互作用。UPN處理的BMDM和BMSC共培養(yǎng)的示意圖如圖所示（圖 5A).堿性磷酸酶染色檢測(cè)BMSCs成骨礦化情況，發(fā)現(xiàn)IL-4+UPN組BMSC堿性磷酸酶活性在第7天較Ctrl組明顯升高（圖 5B 和 C) 和 14 (圖 5D和E)，茜素紅染色結(jié)果顯示，共培養(yǎng)體系中第21天IL-4+UPN組BMSCs礦化結(jié)節(jié)數(shù)量較Ctrl組增加(圖 5F、G）上述結(jié)果證明，超短肽納米纖維可以進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2亞型極化，因此，UPN誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化后，M2巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)因子的旁分泌作用促進(jìn)了BMSCs的成骨分化。
2.7 超聲響應(yīng)UPN@水凝膠在體內(nèi)骨缺損治療中的作用
建立SPF級(jí)8周齡C57BL/6J小鼠骨缺損模型，采用超聲觸發(fā)UPN@水凝膠（圖 6A). 為了直觀觀察愈合過(guò)程，采用micro-CT成像檢查不同組骨缺損的愈合效果。術(shù)后14天，micro-CT重建圖像（圖 6B) 骨缺損部位，以及 X 射線圖像（圖 6C)，通過(guò)Micro-CT掃描定量分析骨缺損愈合區(qū)骨體積/組織體積(BV/TV)及骨小梁厚度(Tb.Th)，結(jié)果顯示US+UPN@hydrogel組骨愈合效果較好(圖 6D 和 E）。此外，從骨缺損部位的組織中提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析表明，US + UPN@ 水凝膠組的成骨蛋白標(biāo)志物 BMP2 和 Col1 含量最高（圖 6F). H&E染色評(píng)價(jià)小鼠骨缺損的修復(fù)能力，結(jié)果顯示小鼠骨缺損區(qū)域新生骨小梁逐漸被新生骨替代（圖 6G).成骨基因標(biāo)志物BMP2免疫熒光檢測(cè)呈紅色熒光，且US+UPN@hydrogel組熒光強(qiáng)度最強(qiáng)于Ctrl組（圖 6H).以上結(jié)果證實(shí)了應(yīng)用超聲引發(fā)的超短肽納米纖維水凝膠材料可以有效改善骨缺損的再生。
2.8 UPN@hydrogel的體內(nèi)毒性研究
本研究將UP@hydrogel（記為US+UP@hydrogel）和UPN@hydrogel（記為US+UPN@hydrogel）局部植入小鼠骨缺損部位。UP@hydrogel為單體肽水凝膠，UPN@hydrogel為組裝肽納米纖維水凝膠。利用超聲刺激引發(fā)水凝膠的治療反應(yīng)。治療14天后，用H&E染色檢查心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的藥物毒性，結(jié)果顯示這些器官?zèng)]有炎癥浸潤(rùn)或病理改變（圖 7A). 在我們的研究中，我們進(jìn)行了體內(nèi)評(píng)估以評(píng)估 UPN@hydrogel 的安全性。仔細(xì)提取血清樣本，以研究肝臟、腎臟和心臟功能以及炎癥反應(yīng)的潛在變化。為了全面分析 UPN@hydrogel 的安全性，我們對(duì)提取的血清樣本進(jìn)行了徹底的評(píng)估。我們的重點(diǎn)是監(jiān)測(cè) UPN@hydrogel 引入引起的肝臟、腎臟和心臟功能的任何變化。此外，我們還仔細(xì)研究了水凝膠應(yīng)用引起的炎癥反應(yīng)。我們測(cè)試了肝功能指標(biāo)，包括堿性磷酸酶 (ALP)、白蛋白 (ALB) 和總膽紅素 (TBIL) (圖 7B–D）。腎功能指標(biāo)包括尿素（UREA）、尿酸（UA）、肌酐（CREA）（圖 7E–G）。心臟功能指標(biāo)包括乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）（圖 7H–J)。結(jié)果顯示治療后肝/腎/心臟功能在正常范圍內(nèi)。我們檢測(cè)的炎癥因子包括IL-6、CXC10、IFN-r（圖 7KM)。顯微鏡下觀察800 μg/ml UP和UPN作用0、48、72 h時(shí)巨噬細(xì)胞的活性情況,可見(jiàn)細(xì)胞狀態(tài)良好,說(shuō)明UP和UPN無(wú)明顯毒性(圖 S7 AC),隨后采用CCK-8法檢測(cè)0~800 μg/ml UPN@hydrogel處理BMDMs和BMSCs 0、48、72 h后的活力,結(jié)果顯示UPN對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有影響(圖 S7 DF）。
3 討論
繼續(xù)探索能夠改變巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)、建立有利于骨再生的免疫微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)分子和生物材料至關(guān)重要。[19]此外，最近的研究表明，M2型巨噬細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子和外泌體，幫助調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。[20]。改善促進(jìn) BMSCs 成骨分化的免疫微環(huán)境對(duì)于骨缺損的修復(fù)至關(guān)重要。ECM 蛋白在成骨細(xì)胞分化和骨再生中起著至關(guān)重要的作用[21]牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白 1 (DMP1) 是一種在骨骼中高度表達(dá)的關(guān)鍵 ECM 蛋白，可調(diào)節(jié)骨礦化[22],在DMP1基因突變的遺傳小鼠模型中，基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果顯示，DMP1的缺失與骨骼中免疫信號(hào)通路的改變密切相關(guān)[23]。有趣的是，DMP1氨基酸序列富含氨基酸S或E，S:E比例接近3:2。為了促進(jìn)骨質(zhì)疏松模型中的BMSC分化，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了超短肽SESSE[24]。最近，我們的研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)，即DMP1及其衍生肽，包括SESSE，具有調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞極化的能力（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。然而，SESSE肽是否能有效調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境促進(jìn)骨再生仍不清楚。此外，SESSE的穩(wěn)定性和壽命有限，對(duì)其臨床轉(zhuǎn)化結(jié)果構(gòu)成挑戰(zhàn)。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了進(jìn)一步研究的必要性，以確定SESSE在促進(jìn)骨再生方面的治療潛力，并解決穩(wěn)定性問(wèn)題，以成功應(yīng)用于臨床。
在這項(xiàng)研究中，我們開(kāi)發(fā)了一種新方法來(lái)增強(qiáng)體內(nèi)采用模塊化超分子自組裝概念，提高超短肽 (UP) 的穩(wěn)定性。具體來(lái)說(shuō)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種名為 SESSE 的肽，它具有自組裝能力，可以形成超分子組裝體，即 UPN（超短肽納米纖維）。UPN 的形成顯著提高了 SESSE 肽在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性和壽命。自組裝肽納米纖維單體包含兩個(gè)功能域：（1）自組裝域 CFF，源自 β 淀粉樣肽，可形成肽序列并提供交聯(lián)位點(diǎn)；[24] 和（2）治療結(jié)構(gòu)域SESSE。在水性條件下，F(xiàn)F結(jié)構(gòu)域的疏水作用和π-π堆積使肽單體自組裝成納米纖維，其中FF結(jié)構(gòu)域形成疏水核心，SESSE肽結(jié)構(gòu)域形成帶負(fù)電荷的親水核心[25]。在本研究中，我們的主要目標(biāo)是創(chuàng)造一個(gè)有利的微環(huán)境，在骨損傷恢復(fù)的早期階段促進(jìn)免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）的分化。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，我們提出利用超聲控制的水凝膠系統(tǒng)在損傷的初期控制釋放高濃度的生物活性寡肽。本質(zhì)上，我們的研究圍繞闡明短期免疫調(diào)節(jié)作用和干細(xì)胞分化特性展開(kāi)。因此，本研究中使用的水凝膠不需要相當(dāng)大的機(jī)械強(qiáng)度或長(zhǎng)期耐久性來(lái)促進(jìn)成骨。然而，這種水凝膠的生物力學(xué)性能和彈性未來(lái)的改進(jìn)將在長(zhǎng)期應(yīng)用中帶來(lái)良好的前景。
此類(lèi)超短肽實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制在之前的研究中尚未明確闡明。[10a]巨噬細(xì)胞通過(guò)代謝重編程被激活，在骨再生過(guò)程中的免疫調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。[4a–8 ] .線粒體作為免疫反應(yīng)的協(xié)調(diào)者，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的代謝平衡，并密切影響巨噬細(xì)胞的表型[26],本研究發(fā)現(xiàn)，UPN@hydrogel通過(guò)激活線粒體功能，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化進(jìn)入M2表型。JC-1是由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在線粒體中積累而產(chǎn)生的。此外，UPN刺激顯著增強(qiáng)了線粒體膜電位標(biāo)志物JC-1聚集體的信號(hào)，增加了線粒體三磷酸腺苷的釋放，降低了線粒體ROS自由基的釋放速率。因此，我們假設(shè)線粒體可能傳遞信號(hào)并以代謝物的形式提供能量來(lái)維持巨噬細(xì)胞表型。
線粒體作為信號(hào)細(xì)胞器，被認(rèn)為是主要的生物能量細(xì)胞器，為細(xì)胞活動(dòng)提供能量，并參與細(xì)胞特異性表型的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。[27]更重要的是，線粒體代謝物在巨噬細(xì)胞極化的誘導(dǎo)和維持中提供信號(hào)，并作為早期檢查點(diǎn)分子發(fā)揮重要作用[28]。本研究表明，UPN@水凝膠 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的 TCA 循環(huán)和糖酵解代謝，其代謝產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞極化至關(guān)重要。琥珀酸是 TCA 循環(huán)中的促炎代謝物，在脂多糖誘導(dǎo)的 M1 巨噬細(xì)胞中積累[15a],我們發(fā)現(xiàn)UPN@hydrogel能明顯降低巨噬細(xì)胞中促炎性琥珀酸。乳酸和葡萄糖-6-磷酸是糖酵解的促炎產(chǎn)物[29]，UPN@水凝膠減弱了巨噬細(xì)胞能量代謝中炎癥代謝物的產(chǎn)生。總的來(lái)說(shuō)，UPN@水凝膠促進(jìn)了抗炎代謝物并抑制了巨噬細(xì)胞TCA循環(huán)和糖酵解中的促炎代謝物，這可能促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。此外，我們的研究表明，UPN還表現(xiàn)出通過(guò)STAT6/PPAR-γ/SOCS3信號(hào)通路調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞極化的額外能力。具體而言，白細(xì)胞介素-4 (IL-4) 激活觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子STAT6，其組裝成活化的轉(zhuǎn)錄激活因子并與特定靶基因結(jié)合，從而促進(jìn)PPAR-γ異二聚化的誘導(dǎo)和隨后的M2巨噬細(xì)胞活化。此外，STAT6抑制了SOCS3的表達(dá)，從而促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化[三十本研究結(jié)果為UPN通過(guò)STAT6/PPAR-γ/SOCS3信號(hào)通路對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮調(diào)控作用的觀點(diǎn)提供了有力的證據(jù)。
為了闡明 UPN 誘導(dǎo)的 M2 型巨噬細(xì)胞和 BMSC 之間復(fù)雜的相互作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種復(fù)雜的共培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)涉及骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞 (BMDM) 和 BMSC。獲得的結(jié)果明確表明，UPN 誘導(dǎo)的 M2 型巨噬細(xì)胞顯著增強(qiáng)了共培養(yǎng)微環(huán)境中生長(zhǎng)因子 BMP2 和 IGF-1 的分泌。這種增強(qiáng)反過(guò)來(lái)又顯著增強(qiáng)了 BMSC 的成骨分化和遷移能力，從而為 UPN 誘導(dǎo)的 M2 型巨噬細(xì)胞在促進(jìn)骨再生方面的潛在作用提供了新的見(jiàn)解。雖然我們之前的研究表明 SESSE 直接促進(jìn)了 BMSC 成骨分化，但需要超過(guò)八周的長(zhǎng)時(shí)間暴露。此外，超聲波還用于控制 SESSE 的釋放。在骨修復(fù)的早期階段，免疫細(xì)胞起著關(guān)鍵作用，而 BMSC 成骨活性通常發(fā)生在三天后。此外，值得注意的是，在體外刺激濃度為 10 至 200 ng/ml 的 UPN 在 6-24 小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出對(duì) BMSC 吞噬的顯著抵抗力。這一有趣的觀察結(jié)果使我們推測(cè) SESSE 水凝膠控制 BMSC 分化的主要機(jī)制是通過(guò)免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)進(jìn)行間接調(diào)節(jié)。通過(guò)影響免疫細(xì)胞群，SESSE 水凝膠可能創(chuàng)造了一個(gè)有利的微環(huán)境，促進(jìn) BMSC 分化和隨后的骨再生。
為了評(píng)估超聲觸發(fā)的 UPN@hydrogel 促進(jìn)骨再生的功效，我們使用 8 周大的 C57BL/6J 小鼠建立了骨缺損模型。隨后，用超聲觸發(fā)的 UPN@hydrogel 治療產(chǎn)生的骨缺損，使我們能夠評(píng)估其在促進(jìn)骨修復(fù)方面的治療潛力。術(shù)后 14 天，結(jié)果顯示 US + UPN@hydrogel 組骨愈合效果更佳。此外，全面的生物學(xué)分析表明，US + UPN@hydrogel 組的骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 (BMP2) 和 I 型膠原蛋白 (Col1) 水平最高，這與我們從體外調(diào)查。使用蘇木精和伊紅 (H&E) 染色的組織學(xué)檢查顯示，小鼠骨缺損區(qū)域內(nèi)新形成的骨小梁逐漸被再生骨取代。針對(duì)成骨基因標(biāo)記物 BMP2 的免疫熒光檢測(cè)顯示強(qiáng)烈的紅色熒光，與對(duì)照 (Ctrl) 組相比，US + UPN@hydrogel 組顯示出最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。這些結(jié)果共同表明，在骨缺損建模開(kāi)始后第 1-3 天進(jìn)行的超聲治療有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 M2 亞型，從而顯著改變骨損傷部位周?chē)拿庖呶h(huán)境，最終增強(qiáng)骨缺損的愈合過(guò)程。重要的是，超聲波的應(yīng)用也有利于自組裝肽從水凝膠中釋放出來(lái)，這是由于超聲波加速，從而促進(jìn)成骨并顯著增強(qiáng)骨缺損的修復(fù)能力。
4 結(jié)論
我們開(kāi)發(fā)了一種超聲觸發(fā)肽納米纖維水凝膠，可有效促進(jìn)骨再生。超短肽 SESSE 設(shè)計(jì)有用于 M2 巨噬細(xì)胞極化和自組裝的模塊，以改變巨噬細(xì)胞狀態(tài)。釋放的肽納米纖維激活巨噬細(xì)胞線粒體中的氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制活性氧釋放，同時(shí)誘導(dǎo) M2 巨噬細(xì)胞加速骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化�？傊@項(xiàng)研究為基于超短肽的活性組織工程提供了一種新途徑，其中可以設(shè)計(jì)基于超短肽的生物活性材料來(lái)促進(jìn)組織損傷再生。
5 實(shí)驗(yàn)部分/方法
5.1 超短肽納米纖維的制備
每次實(shí)驗(yàn)將凍干肽溶解于二甲基亞砜 (DMSO) 中，濃度為 10.0 mg/ml，制備新鮮的 CFFSESSE 肽原液，以避免預(yù)聚集。然后，將 0.5 ml 肽原液滴入 2.0 ml 去離子水溶液中，靜置 5 min。混合物再振蕩 12 h，得到自組裝的超短肽納米纖維。最后，用去離子水透析 2 d 去除有機(jī)溶劑。將制備好的超短肽納米纖維凍干保存。
5.2 負(fù)載肽納米纖維的超聲響應(yīng)水凝膠的制備
為了將肽納米纖維裝入水凝膠中，將 5.0 毫克制備好的肽納米纖維與 1 毫升 2.5% (重量/體積) 海藻酸鈉，然后將其加入 1.0 ml 0.1 M 氯化鈣 (CaCl2)溶液，靜置10分鐘。用去離子水清洗負(fù)載肽納米纖維的水凝膠。
5.3 超短肽納米纖維的形貌
用掃描電子顯微鏡（Zeiss Sigma 300 VP 儀器）評(píng)估超短肽納米纖維的形態(tài)。在 2 kV 下使用電子模式兩次記錄特征。
5.4 超短肽納米纖維的性能
5.4.1紫外可見(jiàn)光譜
紫外-可見(jiàn)吸收光譜采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（INESA，中國(guó)）在 25 ℃ 下測(cè)量。波長(zhǎng)范圍設(shè)定為 200~650 nm，掃描速度為中等。
5.4.2 模量
使用 HAKKE 流變儀對(duì)海藻酸鈣水凝膠進(jìn)行流變分析。使用振蕩條件下的應(yīng)變掃描實(shí)驗(yàn)測(cè)量水凝膠的粘彈性。掃描測(cè)試 0.1% 至 10% 的應(yīng)變，以記錄儲(chǔ)能模量 (G′) 和損耗模量 (G″) 值。所有運(yùn)行均使用不同的樣品作為重復(fù)。使用的頻率為 1 Hz，間隙寬度為 5 mm。
5.4.3 水凝膠降解和超聲波響應(yīng)降解
凝膠化后，在 37°C 的溫度下仔細(xì)稱量水凝膠（W0）。隨后，將其浸入 pH 值為 7.4 的磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 中，以創(chuàng)建適當(dāng)?shù)纳硐嚓P(guān)環(huán)境。然后，從樣品中除去外部水，并以特定間隔稱量樣品（WS）。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行三次。對(duì)于超聲響應(yīng)降解實(shí)驗(yàn)，以間隔時(shí)間（20 kHz、45 W、3 分鐘）使用超聲波處理樣品。在上述實(shí)驗(yàn)中，所有樣品均在除去外部水后稱重。
5.4.4 肽釋放和超聲響應(yīng)釋放
在有或沒(méi)有超聲照射的情況下分析水凝膠釋放肽。將含有肽的水凝膠浸入5.0 ml PBS緩沖液（pH 7.4）中。在預(yù)設(shè)的時(shí)間間隔后，從混合溶液中收集1.0 ml溶液，并加入相同體積的新鮮PBS。然后使用熒光分光光度計(jì)分析肽的濃度。在超聲刺激的肽釋放實(shí)驗(yàn)中，使用超聲波（20 kHz，45 W，3分鐘）以特定間隔照射樣品。然后，提取1.0 ml溶液并使用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行分析。
5.5 小鼠股骨缺損模型的建立
本實(shí)驗(yàn)經(jīng)同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019-DW-040）。實(shí)驗(yàn)使用8周齡雄性C57BL/6J小鼠36只。小鼠飼養(yǎng)在無(wú)特定病原體（SPF）環(huán)境中，溫度（22±1℃）和濕度（40%～60%）可控，光照/黑暗周期為12小時(shí)，提供食物和水。手術(shù)器械在術(shù)前高壓滅菌，10%水合氯醛（3 ml/kg）靜脈注射。小鼠麻醉后移至實(shí)驗(yàn)臺(tái)，手術(shù)部位用3%碘酊溶液和75%酒精消毒。隨后，切開(kāi)小鼠股骨皮膚，鈍性剝離肌肉和筋膜，暴露股骨，0.使用直徑8 mm球形鉆頭穿透一側(cè)骨皮質(zhì)，立即將超短肽納米纖維水凝膠局部置于骨缺損部位，再用可吸收4-0細(xì)絲縫合皮膚，構(gòu)建股骨損傷修復(fù)模型。術(shù)后使用抗生素控制感染，電熱床墊（38.3±0.5）℃為動(dòng)物保暖，待動(dòng)物完全從麻醉中蘇醒后放回合適籠具。小鼠骨缺損手術(shù)后前3天在缺損部位涂抹醫(yī)用耦合劑，超聲治療2 min，強(qiáng)度為1.75 W/cm用可吸收4-0細(xì)絲縫合皮膚，構(gòu)建股骨損傷修復(fù)模型。術(shù)后使用抗生素控制感染，電熱床墊（38.3±0.5）℃為動(dòng)物保暖。待動(dòng)物完全從麻醉中蘇醒后，放回相應(yīng)籠子。小鼠骨缺損手術(shù)后前3天在缺損處涂抹醫(yī)用耦合劑，超聲治療2分鐘，1.75 W/cm用可吸收4-0細(xì)絲縫合皮膚，構(gòu)建股骨損傷修復(fù)模型。術(shù)后使用抗生素控制感染，電熱床墊（38.3±0.5）℃為動(dòng)物保暖。待動(dòng)物完全從麻醉中蘇醒后，放回相應(yīng)籠子。小鼠骨缺損手術(shù)后前3天在缺損處涂抹醫(yī)用耦合劑，超聲治療2分鐘，1.75 W/cm小鼠骨缺損手術(shù)后，前三天在缺損部位涂抹醫(yī)用耦合劑，以1.75 W/cm2 的功率進(jìn)行 2 分鐘的超聲治療小鼠骨缺損手術(shù)后，前三天在缺損部位涂抹醫(yī)用耦合劑，以1.75 W/cm2 的功率進(jìn)行 2 分鐘的超聲治療2瓦/平方米（1 M/Hz）。本次實(shí)驗(yàn)中的小鼠被分為六組：（1）Ctrl 組：未進(jìn)行任何治療的組（表示為“對(duì)照組”）；（2）未加載水凝膠組：未負(fù)載海藻酸鈣水凝膠（記為“未負(fù)載水凝膠組”）；（3）UP@水凝膠組：超短肽負(fù)載海藻酸鈣水凝膠（記為“UP@水凝膠組”）；（4）美國(guó)+UP@水凝膠組：超聲處理+超短肽負(fù)載海藻酸鈣水凝膠（記為“US+UP@水凝膠組”）；（5）UPN@水凝膠組：超短肽納米纖維負(fù)載海藻酸鈣水凝膠（記為“UPN@水凝膠組”）；（6）美國(guó)+UPN@hydrogel 組：超聲處理+超短肽納米纖維負(fù)載海藻酸鈣水凝膠（記為“US+UPN@水凝膠組”）。每組6只實(shí)驗(yàn)小鼠。
5.6 微型計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）檢測(cè)骨缺損修復(fù)
對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組共36只小鼠在股骨損傷后14天被安樂(lè)死。使用micro-CT系統(tǒng)（micro-CT50，瑞士）分析骨缺損樣本。簡(jiǎn)而言之，每個(gè)樣本從骨缺損處掃描80層，包括整個(gè)骨損傷區(qū)域，并在70 kV和200 mA下量化選定區(qū)域內(nèi)所有骨小梁的骨密度，空間體素大小為10μm。此外，從micro-CT分析中再生以下骨密度參數(shù)：小梁體積/總體積（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）。
5.7 生物測(cè)定
5.7.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的分離和培養(yǎng)
對(duì)36只SPF級(jí)4周齡C57BL/6J小鼠實(shí)施無(wú)痛安樂(lè)死后，將小鼠浸泡在75％乙醇中10分鐘。在股骨和脛骨處切開(kāi)皮膚，然后無(wú)菌分離股骨，并浸泡在含有青霉素-鏈霉素的無(wú)菌PBS溶液中。然后，去除股骨和脛骨周?chē)募∪夂徒Y(jié)締組織，并在雙抗菌PBS溶液中沖洗三次。接下來(lái)，切開(kāi)股骨和脛骨的兩端，暴露骨髓腔。用2 ml注射器用完全培養(yǎng)液沖洗樣品三次。此外，骨髓腔還要沖洗數(shù)次，直至骨壁顏色變白。然后將細(xì)胞懸液通過(guò)200目尼龍網(wǎng)至15 ml離心管中，并在2000 rpm下離心5分鐘。棄去上清液，用紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，4 ℃裂解10 min，加入等量培養(yǎng)基終止紅細(xì)胞裂解，2000 rpm 離心5 min，計(jì)數(shù)細(xì)胞，接種于10 cm 培養(yǎng)皿，37 ℃、5% CO 培養(yǎng)2濕度飽和。
5.7.2 小鼠骨髓巨噬細(xì)胞（BMDM）的分離
從小鼠骨髓腔中提取細(xì)胞的過(guò)程與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的過(guò)程類(lèi)似，直到紅細(xì)胞裂解，然后將細(xì)胞重新懸浮在 M-CSF 培養(yǎng)基（40 ng/ml）（重組小鼠 M-CSF；Petroleum Technology，Rocky Mountain，NJ）中。第 2 天和第 3 天補(bǔ)充含有 M-CSF 的培養(yǎng)基，第 5 天添加新鮮的 M-CSF 培養(yǎng)基。這體外實(shí)驗(yàn)包括四組：（1）Ctrl 組：未接受任何治療的組（表示為“對(duì)照組”）；（2）IL-4組：用IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞（標(biāo)記為“IL-4組”）；（3）UPN 組：用超短肽納米纖維誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞（記為“UPN組”）；（4）IL-4+UPN組：用IL-4和超短肽納米纖維誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞（表示為“IL-4+UPN組”）。
5.7.3 免疫熒光
免疫熒光染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化及干細(xì)胞成骨能力。六組均在骨損傷治療后14 d處死，收集骨缺損處的股骨，用4%多聚甲醛固定，固定48 h后將收集的組織放入10%EDTA中放置4周，每2 d更換一次脫鈣液。脫鈣標(biāo)本用PBS清洗，用30%蔗糖溶液脫水48 h后浸入Tissue-Tek® O⋅CT包埋。用低溫切片機(jī)（德國(guó)Leica Microsystems）連續(xù)切割骨缺損處，每層厚度均勻?yàn)? μm，切割后的標(biāo)本室溫放置30 min后，放入4 ℃丙酮中10 min。烘干30 min后，PBS洗滌3次，每次5 min。隨后，用10%山羊血清在室溫下封閉切片1 h，進(jìn)行免疫熒光染色。將用適當(dāng)比例稀釋的一抗工作液（BMP2，1:200，Bioss）的PBS滴加到樣品中，在4 ℃避光環(huán)境中孵育過(guò)夜。用PBS滴洗3次，每次10 min，然后加入適當(dāng)稀釋的二抗工作液和鼠源抗體（594，1:1000，Thermo Fisher）。在共聚焦顯微鏡（NIS Elements，Nikon，日本）下，使用專(zhuān)門(mén)的圖像軟件（ImageJ，NIH，美國(guó)）進(jìn)行分析。切片用10%羊血清室溫封閉1h后進(jìn)行免疫熒光染色。將用適當(dāng)比例稀釋的一抗工作液(BMP2,1:200,Bioss)的PBS滴加到樣品中，4℃避光孵育過(guò)夜。用PBS滴洗三次，每次10min，然后加入適當(dāng)稀釋的二抗工作液和鼠源抗體(594,1:1000,Thermo Fisher)。在共聚焦顯微鏡(NIS Elements,Nikon,Japan)下，使用專(zhuān)門(mén)的圖像軟件(ImageJ,NIH,USA)進(jìn)行分析。切片用10%羊血清室溫封閉1h后進(jìn)行免疫熒光染色。將用適當(dāng)比例稀釋的一抗工作液(BMP2,1:200,Bioss)的PBS滴加到樣品中，4℃避光孵育過(guò)夜。用PBS滴洗三次，每次10min，然后加入適當(dāng)稀釋的二抗工作液和鼠源抗體(594,1:1000,Thermo Fisher)。在共聚焦顯微鏡(NIS Elements,Nikon,Japan)下，使用專(zhuān)門(mén)的圖像軟件(ImageJ,NIH,USA)進(jìn)行分析。PBS滴洗3次，每次10 min，加入適當(dāng)稀釋的二抗工作液及鼠源抗體（594，1:1000，Thermo Fisher），在共聚焦顯微鏡（NIS Elements，日本尼康）下，采用專(zhuān)門(mén)的圖像軟件（ImageJ，美國(guó)NIH）進(jìn)行分析。PBS滴洗3次，每次10 min，加入適當(dāng)稀釋的二抗工作液及鼠源抗體（594，1:1000，Thermo Fisher），在共聚焦顯微鏡（NIS Elements，日本尼康）下，采用專(zhuān)門(mén)的圖像軟件（ImageJ，美國(guó)NIH）進(jìn)行分析。
為了評(píng)估細(xì)胞遷移，將細(xì)胞在室溫下用 4% 多聚甲醛固定 20 分鐘，用 PBS 清洗，然后用 10% 山羊血清封閉 1 小時(shí)。用 PBS 再次清洗細(xì)胞 3 次，每次 5 分鐘。將用適當(dāng)比例的一抗工作溶液（Arg1，1:200，Bioss；CD206，1:200，Proteintech；p-stat6，1:100，Cell Signal）稀釋的 PBS 逐滴加入樣品中，并在黑暗環(huán)境中在 4 °C 下孵育過(guò)夜。在共聚焦顯微鏡（NIS Elements，尼康，日本）下，使用專(zhuān)業(yè)圖像軟件（ImageJ，NIH，美國(guó)）進(jìn)行分析。
5.7.4 蛋白質(zhì)印跡法
將預(yù)冷的裂解緩沖液加入細(xì)胞中，但在裂解前向細(xì)胞中加入 50 μl 蛋白酶抑制劑和 50 μl 磷酸酶抑制劑。接下來(lái)，將 250 μl WB Super RIPA 裂解緩沖液加入到 1 × 10 6細(xì)胞，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物各2.5 μl。將混合物置于冰上使細(xì)胞裂解30分鐘，然后在4°C以13,000 rpm離心5分鐘。收集上清液，其中含有需要提取的蛋白質(zhì)。使用BCA技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算所得樣品的濃度。與適當(dāng)緩沖液混合后，5×十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠在70°C下加熱10分鐘以變性。使用SDS-PAGE和PVDF膜有效地分離蛋白質(zhì)提取物，所述膜用純甲醇飽和5秒鐘。用快速阻斷溶液（Biotech，NO。C510053）進(jìn)行蛋白質(zhì)阻斷，并將樣品與稀釋的一抗在4°C下孵育過(guò)夜。TBST（Biotech，No.使用二抗（C006161）洗PVDF膜三次，每次10 min。加入稀釋后的二抗，孵育1 h。PVDF膜顯影采用化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce公司，美國(guó)）。一抗工作液為：BMP2，1：1000（Bioss公司，中國(guó)）；Col1，1：1000（Bioss公司，中國(guó)）；Arg1，1：1000（Bioss公司，中國(guó)）；CD206，1：1000（Proteintech公司，美國(guó)）。二抗工作液為：A32790，1：1000；A32729，1：1000（Thermo Fisher公司，中國(guó)）。Arg1，1：1000（Bioss，中國(guó)）；CD206，1：1000（Proteintech，美國(guó)）；二抗工作液為：A32790，1：1000；A32729，1：1000（Thermo Fisher，中國(guó)）。Arg1，1：1000（Bioss，中國(guó)）；CD206，1：1000（Proteintech，美國(guó)）；二抗工作液為：A32790，1：1000；A32729，1：1000（Thermo Fisher，中國(guó)）。
5.7.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-qPCR)
根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用 TRIzol（Takara，中國(guó)）試劑提取 RNA，并使用 HiScript II Q RT SuperMix 將 1.0 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。所有數(shù)據(jù)均基于β-actin 作為基于先前研究的統(tǒng)一參考[27].RT-qPCR引物序列如下：
5.7.7 堿性磷酸酶活性檢測(cè)
分離培養(yǎng) BMSC 后，以 6×10 4 個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于 12 孔板中，培養(yǎng) 7 和 14 天。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 80% 時(shí)進(jìn)行堿性磷酸酶 (ALP) 染色。堿性磷酸酶顯色液按照制造商的說(shuō)明制備（Mlbio，上海，中國(guó)）。使用 PBS（PromoCell，英國(guó)）沖洗樣品兩次，每次 5 分鐘。將孔中的細(xì)胞在室溫下用 4% 多聚甲醛固定 30 分鐘，并使用 diH2O.然后，將細(xì)胞在37°C下孵育30分鐘，用diH2O并干燥。用光學(xué)顯微鏡（Leica，英國(guó)）在20倍放大倍數(shù)下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，堿性磷酸酶染色呈現(xiàn)藍(lán)色。
5.7.8 細(xì)胞毒性測(cè)試體外
UP組和UPN組提前孵育6 h，濃度分別為6.25 ng/ml、12.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml和200 ng/ml，不同濃度活性肽暴露細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間為0、48和72 h。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，具體操作參照廠家說(shuō)明。每2 ml培養(yǎng)基加入100 μl CCK-8，孵育2 h。使用Gen5™酶標(biāo)儀（BioTek儀器）在450 nm處對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)（12孔板3×3點(diǎn)），并在顯微鏡下觀察細(xì)胞的活性狀態(tài)。
5.7.9 細(xì)胞毒性測(cè)試體內(nèi)
骨缺損小鼠，US+UP@hydrogel組放置超短肽水凝膠，US+UPN@hydrogel組放置超短肽納米纖維水凝膠，兩組均進(jìn)行超聲處理。14天后取其心臟、腎臟、脾臟、肺臟和肝臟進(jìn)行蘇木精和伊紅（H&E）染色，觀察這些器官的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)，并密切觀察小鼠的狀態(tài)。
5.8 統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用 SPSS 19.0 軟件（SPSS，芝加哥，IL）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用 Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。使用單因素方差分析 (ANOVA) 檢驗(yàn)變量的顯著性影響。使用多重比較 Tukey 檢驗(yàn)在預(yù)設(shè)的 alpha 為 0.05 時(shí)比較數(shù)據(jù)。P 值 < 0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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