摘要：該文總結(jié)了二次離子質(zhì)譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜和常壓敞開式離子化質(zhì)譜三大類型質(zhì)譜分子成像（MSI）技術(shù)的概況、技術(shù)與方法及其應(yīng)用新進(jìn)展。MSI技術(shù)作為免標(biāo)記、高覆蓋、高靈敏、檢測范圍廣的可視化分析手段，不局限于生物組織或細(xì)胞中某種特定分子的檢測，可對(duì)已知和未知多種分子進(jìn)行同時(shí)成像分析，獲得不同分子的空間分布、相對(duì)含量及結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)其分子的定性、定量與定位分析；還可提供不同生理及病理過程中功能分子的動(dòng)態(tài)時(shí)空變化信息等。因此，MSI技術(shù)成為質(zhì)譜領(lǐng)域以及分析化學(xué)等領(lǐng)域的研究前沿與熱點(diǎn)方向之一，并在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、藥學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域顯示出重大應(yīng)用前景。此外，MSI技術(shù)是單細(xì)胞可視化分析和空間分辨代謝組學(xué)的強(qiáng)有力分析手段，可從動(dòng)物或器官組織的整體、微區(qū)、單細(xì)胞等不同空間尺度，獲取具有空間分布特征、時(shí)空動(dòng)態(tài)變化的功能分子全景輪廓信息等而備受關(guān)注。
當(dāng)今質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展非常迅猛，新技術(shù)或新型質(zhì)譜儀的研發(fā)“日新月異”，極大地拓展了質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。其中，隨著1997年Caprioli等人首次將基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI－MS）技術(shù)用于生物組織中多肽和蛋白質(zhì)成像分析后，極大地推動(dòng)了質(zhì)譜成像（MSI）技術(shù)的發(fā)展［1］。20多年來，因不同原理及多種類型MSI技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用拓展，使MSI成為質(zhì)譜領(lǐng)域乃至分析化學(xué)、分子影像技術(shù)以及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究前沿與熱點(diǎn)方向之一。MSI技術(shù)是一種免標(biāo)記，不局限于某種特定分子的新型分子成像技術(shù)，不僅可同時(shí)獲得生物組織或細(xì)胞中多種分子的空間分布、相對(duì)含量及結(jié)構(gòu)信息，還能夠提供不同生理及病理過程中功能分子的動(dòng)態(tài)變化與功能關(guān)聯(lián)的信息［1－2］。目前，根據(jù)不同的離子化方法及工作原理，MSI技術(shù)主要分為三大類型：二次離子質(zhì)譜（SIMS）、MALDI－MSI以及近年來發(fā)展迅速的常壓敞開式離子化質(zhì)譜成像（Ambient MSI）技術(shù)。因MSI技術(shù)具有靈敏度高、專屬性好、無需特異性標(biāo)記、檢測對(duì)象廣以及樣品處理簡單等優(yōu)勢，已在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、藥學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域顯示出重大應(yīng)用前景［2－8］。此外，近年來基于MSI技術(shù)驅(qū)動(dòng)發(fā)展的空間分辨代謝組學(xué)備受關(guān)注，它可實(shí)現(xiàn)原位可視化分析與代謝組整體分析的優(yōu)勢互補(bǔ)，獲取具有空間分布特征、時(shí)空動(dòng)態(tài)變化的功能分子全景輪廓信息［9］。
1 質(zhì)譜分子成像技術(shù)與應(yīng)用
SIMS技術(shù)是一種基于離子束轟擊被測樣品且需在真空下操作的MSI技術(shù)，具有很高的空間分辨率（達(dá)nm級(jí)水平），因此常被用于單細(xì)胞乃至亞細(xì)胞水平的MSI分析［2］。SIMS儀分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)兩種分析模式，二者的區(qū)別主要根據(jù)一次離子在樣品內(nèi)的注入量為標(biāo)準(zhǔn)，通常一次離子束流低于1012個(gè)離子/cm2為靜態(tài)SIMS模式，高于該值為動(dòng)態(tài)SIMS模式；二者常用的離子束種類和質(zhì)量分析器不同，對(duì)樣品表面及其被測物質(zhì)的破壞程度也不同。其中，以Nano SIMS為代表的動(dòng)態(tài)SIMS是破壞性更強(qiáng)的一種，通常采用高能量的一次離子束轟擊樣品表面（正離子模式常用O+2離子源，負(fù)離子模式為Cs+離子源），主要用于金屬等元素的成像分析。
靜態(tài)SIMS的典型代表是飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜（TOF－SIMS）［2，10］。該技術(shù)一般采用雙束離子源，即一個(gè)離子源（如Ar+n氬團(tuán)簇離子）負(fù)責(zé)對(duì)樣品表面進(jìn)行濺射剝離，另一個(gè)離子源常用Ni+3液態(tài)金屬離子槍（團(tuán)簇離子）等負(fù)責(zé)被測物的離子化，獲得離子在縱向的分布信息。靜態(tài)SIMS分析要求一次離子束流應(yīng)低于1012/cm2，以降低一次離子對(duì)樣品表面的破壞，使一次離子只與樣品表面的原子層作用，而且團(tuán)簇離子對(duì)于樣品表面及其有機(jī)分子的破壞性會(huì)變?nèi)酰虼薚OF－SIMS技術(shù)不僅用于生物組織或細(xì)胞中的元素分析，還可用于藥物和脂類代謝物等生物及有機(jī)分子的成像分析。然而，TOF－SIMS技術(shù)需在真空下操作，尤其是對(duì)于生物及有機(jī)分子的檢測，因其離子化過程主要產(chǎn)生的是碎片離子，難以獲得被測化合物的分子離子等完整結(jié)構(gòu)信息；或者因碎片離子多、其信號(hào)強(qiáng)度很高，則會(huì)掩蓋分子離子的信號(hào)。
另外，值得指出的是德國吉森大學(xué)Spengler團(tuán)隊(duì)致力于高空間分辨的大氣壓MALDI離子源及其MSI技術(shù)的研究。他們采用獨(dú)特的激光束與離子流同軸設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)大氣壓條件下的激光解吸離子化，研發(fā)出TransMIT AP－SMALDI 5 AF高分辨與自動(dòng)聚焦3D快速M(fèi)SI系統(tǒng)［29］，其空間分辨率可達(dá)3 μm；自動(dòng)聚焦MALDI－MSI技術(shù)能夠提升檢測效率與分析通量，可實(shí)現(xiàn)組織切片和非平坦表面的三維化學(xué)形貌以及生物樣品的高分辨、高速掃描及成像分析。從目前的結(jié)果來看，該系統(tǒng)主要針對(duì)脂質(zhì)類代謝物的檢測，且靈敏度有待提高。此外，近期Capolupo等［30］采用高分辨AP－SMALDI 10和AP－SMALDI 5 AF MSI技術(shù)，結(jié)合單細(xì)胞mRNA測序，解析真皮成纖維細(xì)胞的脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息，發(fā)現(xiàn)真皮成纖維細(xì)胞存在多種脂質(zhì)組成狀態(tài)，且脂質(zhì)在決定細(xì)胞狀態(tài)中起著驅(qū)動(dòng)作用。該研究表明單細(xì)胞脂質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組之間存在緊密聯(lián)系，細(xì)胞特定脂型影響信號(hào)受體的活性，促進(jìn)細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。
此外，Eberlin等開發(fā)了簡易敞開式聲波噴霧離子化技術(shù)（EASI）［41］，并采用EASI－MSI技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)物的成像分析［42］。Vertes等研發(fā)出一種LAESI技術(shù)［43］，利用LAESI－MSI實(shí)現(xiàn)了富含水分的小鼠腦組織中小分子及脂質(zhì)類代謝物的成像分析［44］，并通過將不同深度的獨(dú)立二維成像相疊加獲得三維組織成像結(jié)果［45］。Fernández等［46］開發(fā)了一種紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)電離（IR－LAMICI）技術(shù)，通過將樣品表面的分子消融并解吸，使被分析物與處于激發(fā)態(tài)的亞穩(wěn)態(tài)氣體分子相互作用而實(shí)現(xiàn)離子化，并對(duì)小分子進(jìn)行成像分析。Feider等［47］研發(fā)出基于液相微連接表面采樣探針（LMJ－SSP）的敞開式MSI方法，實(shí)現(xiàn)了大鼠腦組織、人卵巢癌組織和正常組織切片中磷脂酰膽堿和多種蛋白質(zhì)的成像分析。
近年來，我國科技人員亦開發(fā)出一系列新型敞開式離子化技術(shù)，其中一些技術(shù)作為MSI方法應(yīng)用于分子可視化分析。例如，張新榮等利用低溫等離子體（LTP）低溫?zé)o損等特點(diǎn)，研發(fā)出一種新型結(jié)構(gòu)的LTP探針離子化技術(shù)［48］，建立了樣品表面原位無損分析的MSI方法［49］，并基于印章油墨成分的MSI分析，實(shí)現(xiàn)了藝術(shù)品真品與贗品的鑒別。劉虎威等通過整合三波長激光解吸附，利用等離子體對(duì)解吸的樣品進(jìn)行離子化，并與薄層色譜技術(shù)聯(lián)用，開發(fā)了PAMLDI技術(shù)［50］及其敞開式MSI方法［51］，實(shí)現(xiàn)了印章、打印字以及中藥黃芩中有效成分分布的成像分析。
本課題組與清華大學(xué)王曉浩課題組合作，2005年以來致力于常壓敞開式離子化及其MSI技術(shù)的研究，研發(fā)出新型的空氣動(dòng)力輔助離子化技術(shù)（AFADESI）［52］（見圖4）。該技術(shù)擴(kuò)展了待測樣品空間和操作靈活性，提高了敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)的離子化效率及檢測靈敏度�；贏FADESI技術(shù)的特點(diǎn)，進(jìn)一步研制出便捷、高靈敏的質(zhì)譜分子成像技術(shù)與裝置（AFADESI－MSI）［53－58］和辨識(shí)度強(qiáng)的MSI軟件MassImager［59］。近年來，先后建立了無需切割的整體動(dòng)物體內(nèi)藥物分析MSI方法［53］，無需添加內(nèi)標(biāo)的虛擬校正定量MSI分析方法［55］，高靈敏、高覆蓋的代謝物MSI分析新方法［57］（見圖5）和水凝膠輔助組織原位衍生化的MSI分析方法［58］等一系列成像分析新方法。采用建立的方法實(shí)現(xiàn)了藥物靶向分布表征、腫瘤原位標(biāo)志物篩查、組織微區(qū)中功能代謝物的精準(zhǔn)表征；同時(shí)解決了低豐度或難電離分子的MSI檢測技術(shù)難題，實(shí)現(xiàn)了高覆蓋、寬動(dòng)態(tài)范圍的十余種1 500個(gè)代謝物的成像分析等。
可見，敞開式離子化質(zhì)譜及其Ambient MSI技術(shù)推動(dòng)了MSI技術(shù)的新發(fā)展，并拓展了MSI技術(shù)在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用途徑。然而，Ambient MSI技術(shù)的空間分辨率低（一般為50~100 µm），限制了單細(xì)胞水平的成像分析；同時(shí)針對(duì)生物組織中不同類型分子，尤其是低含量或難電離的化合物，還需要發(fā)展基于化學(xué)選擇性的手段來提高全面的離子化效果，解決原位信號(hào)放大及檢測靈敏度等難題。
2 空間分辨代謝組學(xué)方法與應(yīng)用
近20年來，代謝組學(xué)及其應(yīng)用取得迅速發(fā)展，成為生命組學(xué)的重要組成部分，已在化學(xué)、生物學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥學(xué)等領(lǐng)域顯示出巨大發(fā)展前景。其中，單細(xì)胞代謝組學(xué)入選IUPAC“2021年度化學(xué)領(lǐng)域十大新興技術(shù)之一”，更加備受關(guān)注。此外，空間分辨多組學(xué)入選Nature雜志“2022年度七大榜單技術(shù)”，其中空間分辨代謝組學(xué)是很重要的發(fā)展方向，因此將MSI技術(shù)與代謝組學(xué)整合，發(fā)展空間分辨代謝組學(xué)方法，可實(shí)現(xiàn)代謝組整體分析與原位可視化分析的優(yōu)勢互補(bǔ)，更有利于獲取具有空間分布特征、時(shí)空動(dòng)態(tài)變化的綜合分子輪廓信息［9，60］。深入開展生物組織中代謝物的成像與原位分析，能夠深層次地理解其在生命活動(dòng)及病變過程中的作用和機(jī)制［61］，尤其是發(fā)展單細(xì)胞空間分辨代謝組學(xué)方法，可發(fā)掘代謝組在組織微區(qū)和細(xì)胞間的差異分布，實(shí)現(xiàn)微環(huán)境中不同代謝特征細(xì)胞的分子識(shí)別與分型精準(zhǔn)表征［62－64］。
需要指出的是，發(fā)展空間分辨代謝組學(xué)可為組織代謝異質(zhì)性及細(xì)胞微環(huán)境的分子可視化研究提供新的創(chuàng)新手段。其中，惡性腫瘤在演進(jìn)過程中，腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境表現(xiàn)出高度的空間與時(shí)間異質(zhì)性［65］；腫瘤異質(zhì)性及其微環(huán)境是癌癥治療失敗和產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵因素，較低的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性與患者預(yù)后良好之間存在高度相關(guān)性［66－67］，也有可能是免疫治療成敗的決定性因素［68］；而腫瘤間異質(zhì)性是腫瘤分子分型、分級(jí)和分期的生物學(xué)基礎(chǔ)［69］。此外，腫瘤代謝異質(zhì)性是腫瘤異質(zhì)性的重要表現(xiàn)形式［70］；而腫瘤細(xì)胞的代謝表型不僅與基因型相關(guān)，也與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，可直接反映基因與環(huán)境的共同作用，這為研究腫瘤異質(zhì)性提供了新的思路［71］。因此，發(fā)展空間分辨代謝組學(xué)或單細(xì)胞空間分辨代謝組學(xué)新方法，對(duì)全面了解生物組織或細(xì)胞微環(huán)境的功能分子構(gòu)成及其動(dòng)態(tài)變化具有重要意義，尤其為疾病發(fā)病機(jī)制與診療新技術(shù)研究、藥物耐藥性、藥物靶向精細(xì)化分布表征及藥效作用與毒性機(jī)制研究甚至新作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)等諸多研究領(lǐng)域提供新的視角和創(chuàng)新手段。
本課題組將AFADESI－MSI技術(shù)與代謝組學(xué)相結(jié)合，2015年在國際上首次提出了質(zhì)譜成像代謝組學(xué)新方法（Ambient mass spectrometry imaging metabolomics method）［60］（見圖6）；研究表明，MSI這一可視化分析技術(shù)與液相色譜－質(zhì)譜（LC－MS）、氣相色譜－質(zhì)譜（GC－MS）等手段相比，在代謝組原位表征方面顯示出獨(dú)特優(yōu)勢。幾乎同時(shí)Takats等［72］基于DESI－MSI技術(shù)提出空間分辨代謝表型（Spatially resolved metabolic phenotyping）分析方法，并應(yīng)用于乳腺癌的研究。之后上述提法演變?yōu)椤翱臻g分辨代謝組學(xué)”，并與空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)等其它組學(xué)構(gòu)成空間分辨多組學(xué)技術(shù)而被高度關(guān)注。這些年，本課題組系統(tǒng)開展了基于AFADESI－MSI技術(shù)的空間分辨代謝組學(xué)分析方法及其應(yīng)用研究［60，73－80］，將建立的方法用于候選新藥的藥效機(jī)制及中藥活性成分的毒性機(jī)制研究［60，74］，提出“下游代謝物與上游代謝酶關(guān)聯(lián)”表征腫瘤代謝改變的研究策略，發(fā)現(xiàn)食管癌代謝特征與異常表達(dá)的6個(gè)關(guān)鍵代謝酶［73］（見圖7），并在腫瘤小分子標(biāo)志物的原位篩查與癌癥的分子分型［75－76］，腫瘤異質(zhì)性研究［77］，糖尿病腎病/腦病發(fā)病機(jī)制以及藥物干預(yù)作用［78－79］和大鼠腦代謝網(wǎng)絡(luò)表征新方法［80］等方面取得重要進(jìn)展。
3 結(jié)論與展望
質(zhì)譜技術(shù)以其廣譜性、靈敏度高、特異性好和檢測動(dòng)態(tài)范圍寬等特點(diǎn)成為目前最主要的分析手段之一，并顯示出很強(qiáng)的生命力和發(fā)展空間。而將質(zhì)譜分析與影像技術(shù)相結(jié)合的質(zhì)譜分子成像技術(shù)，作為免標(biāo)記、高覆蓋、高靈敏、檢測范圍廣的原位可視化分析手段，不局限于生物組織或細(xì)胞中某種特定分子，可對(duì)已知和未知（目標(biāo)/非目標(biāo)）的多種類分子進(jìn)行成像分析，同時(shí)獲得不同分子的空間分布、相對(duì)含量及結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)其分子的定性、定量與定位分析，還可提供不同生理及病理過程中功能分子的動(dòng)態(tài)時(shí)空變化信息等，而備受關(guān)注。因此，目前MSI技術(shù)成為質(zhì)譜領(lǐng)域乃至分析化學(xué)領(lǐng)域的研究前沿和熱點(diǎn)方向之一，并在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、藥學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域顯示出重大應(yīng)用前景。此外，MSI技術(shù)是單細(xì)胞可視化分析和空間分辨代謝組學(xué)的強(qiáng)有力分析手段，并可發(fā)揮不同MSI技術(shù)的優(yōu)勢與功能特點(diǎn)，從動(dòng)物或器官組織的整體、微區(qū)、單細(xì)胞等不同空間尺度，獲取具有空間分布特征、時(shí)空動(dòng)態(tài)變化的功能分子全景輪廓信息，有利于發(fā)展多層次的空間分辨代謝組學(xué)方法。更高的空間分辨率和更高的靈敏度仍是今后MSI技術(shù)的重點(diǎn)發(fā)展目標(biāo)，而單細(xì)胞、3D和定量MSI方法的研究是需要關(guān)注的重要發(fā)展方向。此外，先進(jìn)的質(zhì)譜成像軟件和海量數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)的開發(fā)將促進(jìn)MSI技術(shù)的快速發(fā)展。
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