目的
探討功能性納米自組裝多肽KLPP凝膠對關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)作用。
培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），將BMSCs分為BMSCs-KLD-12組（BMSCs與KLD-12凝膠共培養(yǎng)）和BMSCs-KLPP組（BMSCs與KLPP凝膠共培養(yǎng)），分別行軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性。將人軟骨組織分為軟骨-KLPP組（制作軟骨缺損區(qū)并填充KLPP凝膠進(jìn)行培養(yǎng)）、軟骨-KLD-12組（制作軟骨缺損區(qū)并填充KLD-12凝膠進(jìn)行培養(yǎng)）、軟骨組（僅制作軟骨缺損區(qū)）。Calcein-AM/PI雙染法檢測BMSCs-KLD-12組及BMSCs-KLPP組的細(xì)胞毒性。培養(yǎng)49 d后，收集軟骨組、軟骨-KLD-12組、軟骨-KLPP組的軟骨組織進(jìn)行切片，并行阿爾新藍(lán)染色。Western blot法檢測各組中Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、Ⅱ型膠原（Col-Ⅱ）、Ⅹ型膠原（Col-Ⅹ）的表達(dá)。
結(jié)果
與BMSCs-KLD-12組比較，BMSCs-KLPP組培養(yǎng)1 d、3 d、7 d的細(xì)胞增殖率均明顯增加（P<0.05），且Col-Ⅰ、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ的相對表達(dá)水平明顯增加（P<0.05）。Calcein-AM/PI雙染色檢測表明BMSCs-KLPP組和BMSCs-KLD-12組細(xì)胞活性基本一致，KLPP凝膠無細(xì)胞毒性。與軟骨-KLD-12組比較，軟骨-KLPP組軟骨修復(fù)作用更明顯（P<0.05），且Col-Ⅰ、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ的相對表達(dá)水平更高（P<0.05）。
結(jié)論
關(guān)節(jié)軟骨缺損是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，其特點(diǎn)是軟骨組織部分或完全損壞，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，難以自愈[1-2]。雖然目前已經(jīng)有一些治療軟骨缺損的方法，如自體軟骨移植和骨髓刺激劑等，但往往都存在諸如供體不足、手術(shù)創(chuàng)傷大以及軟骨結(jié)構(gòu)和功能難以恢復(fù)正常等一系列問題。由于關(guān)節(jié)軟骨缺損的發(fā)病原因仍然不明確，藥物治療效果并不明顯，而人工關(guān)節(jié)置換治療的費(fèi)用也相當(dāng)高昂，因此研發(fā)具有修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨作用的誘導(dǎo)療法具有重要意義[3]。
功能性納米自組裝多肽KLPP凝膠因其具有可定制性和廣泛適用性，已成為醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[4]。KLPP凝膠是通過包含部分功能化的側(cè)鏈和肽基之間的共價(jià)和氫鍵相互作用的組合而形成的，其具有在分子水平上進(jìn)行定制的能力，在藥物輸送、組織工程和再生醫(yī)學(xué)方面發(fā)揮重要作用[5]。近年來，可控聚合過程允許增加對多肽水凝膠的流變性和生物學(xué)特性的控制，以滿足各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的特定要求[6]。此外，功能化肽序列在成膠過程中可以通過共價(jià)鍵與其他分子（如蛋白質(zhì)、非編碼RNA、DNA）發(fā)生相互作用，從而產(chǎn)生具有理想特性的多功能水凝膠，如可以緩釋抗菌藥物和生物活性分子的功能性水凝膠[7]。然而，目前還不清楚KLPP凝膠對軟骨損傷修復(fù)的作用。本研究旨在探討KLPP凝膠對軟骨缺損的修復(fù)作用。
1 材料與方法
選取于我院關(guān)節(jié)外科進(jìn)行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的老年雙膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者10例，年齡58～81歲，平均（67.2±5.9）歲；病程3～18年，平均（12.1±1.8）年�；颊呔鶠殡p膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，出現(xiàn)不同程度畸形、痙攣、功能障礙或最大屈曲受限，經(jīng)X射線檢查發(fā)現(xiàn)不同程度功能性退化，間隙異常變小，可見明顯異常病理性改變，結(jié)合臨床癥狀診斷為晚期膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，均采取全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)治療。收集全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中截除丟棄的組織并獲取軟骨組織。本研究經(jīng)患者知情同意，并獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)[2022（科研L）第（51）號]。
在無菌環(huán)境下，隨機(jī)選取3例軟骨組織，用5 mm的環(huán)形組織鏟取出直徑5 mm的圓形軟骨片，使用2 mm的環(huán)形組織鏟在各軟骨片中央制作一個(gè)直徑2 mm的軟骨缺損區(qū)域。使用KLPP凝膠填充軟骨缺損區(qū)域，在37 ℃下于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)液，設(shè)為軟骨-KLPP組。隨機(jī)選取3例軟骨組織用KLD-12凝膠填充，設(shè)為軟骨-KLD-12組，其余操作與軟骨-KLPP組一致。在無菌環(huán)境下，隨機(jī)選取3例軟骨組織制作一個(gè)直徑2 mm的軟骨缺損區(qū)域，在37 ℃下于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)液，設(shè)為軟骨組。處理49 d，收集各組軟骨組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。
人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchyml stem cells,BMSCs）購于上海弗元生物科技有限公司。KLD-12與KLPP凝膠均由實(shí)驗(yàn)室自主合成。溴化乙錠染色試劑和軟骨分化誘導(dǎo)劑Kartogenin（KGN）購于北京百奧萊博公司。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）試劑盒、MTT試劑盒、阿爾新藍(lán)染色試劑盒、茜素紅染色試劑盒均購于上海碧云天生物科技有限公司。鈣黃綠素-乙酰羥甲基酯染色試劑盒購于西安齊岳生物科技有限公司。Ⅰ型膠原（collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ）、Ⅱ型膠原（collagen-Ⅱ，Col-Ⅱ）、X型膠原（collagen-Ⅹ，Col-Ⅹ）、GAPDH的一抗均購于美國Abcam公司。
BMSCs置于DMEM/F12（1∶1，美國Hyclone公司）培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中添加10% FBS（美國Hyclone公司）、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素，在37 °C、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h換液一次，48 h傳代一次，將對數(shù)生長期的BMSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
將BMSCs分為BMSCs-KLD-12組和BMSCs-KLPP組。其中將BMSCs-KLD-12組BMSCs接種到KLD-12凝膠中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞；將BMSCs-KLPP組BMSCs接種到KLPP凝膠中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。用于軟骨分化誘導(dǎo)。
將BMSCs-KLD-12組和BMSCs-KLPP組細(xì)胞原培養(yǎng)液更換為含50 nmol/L KGN的DMEM/F12培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素），于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行軟骨分化誘導(dǎo)，分別培養(yǎng)1 d、3 d、7 d進(jìn)行細(xì)胞增殖和軟骨分化能力的檢測。
BMSCs-KLD-12組和BMSCs-KLPP組誘導(dǎo)軟骨分化后1 d、3 d、7 d分別加入MTT溶液，孵育4~6 h后，將培養(yǎng)皿中的MTT晶體溶解于弱酸性尿素溶液中，然后通過酶標(biāo)儀檢測各組的OD值。
收集BMSCs-KLD-12組和BMSCs-KLPP組的軟骨細(xì)胞，多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，每次5 min。加入抗酶液2 mL孵育30 min，抑制非特異性酶；并將Calcein-AM添加到標(biāo)本中染色15 min：用PBS洗滌標(biāo)本3次，每次5 min，PI染色5 min，去除多余的染色液；將染色后的標(biāo)本放在熒光顯微鏡下拍照觀察。
軟骨-KLPP組、軟骨-KLD-12組和軟骨組的軟骨標(biāo)本培養(yǎng)49 d后，用PBS洗滌3次，每次5 min。用0.1 mol/L的鹽酸溶液處理軟骨切片10 min，在1%阿爾新藍(lán)染色溶液中孵育10 h。隨后拍照觀察。
檢測BMSCs-KLD-12組、BMSCs-KLPP組、軟骨組、軟骨-KLPP組、軟骨-KLD-12組中軟骨分化相關(guān)蛋白，包括Col-Ⅰ、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ。用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞或組織提取總蛋白。蛋白濃度用BCA試劑盒測定。此外，使用12% SDS-PAGE凝膠分離蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉2 h，然后在4 ℃下與一抗孵育10 h。免疫復(fù)合物用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG抗體（1∶5 000）孵育。最后使用Western blot化學(xué)發(fā)光檢測蛋白信號表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。抗體為Col-Ⅰ（1∶1 000）、Col-Ⅱ（1∶1 000）、Col-Ⅹ（1∶1 000）。
數(shù)據(jù)使用GraphPad PRISM 5.01進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。兩組間的數(shù)據(jù)差異采用t檢驗(yàn)。單因素方差分析評估均數(shù)之間的差異，并進(jìn)行LSD-t的多重比較，以評估兩組之間的統(tǒng)計(jì)差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
阿爾新藍(lán)染色顯示：與軟骨組比較，軟骨-KLD-12組和軟骨-KLPP組軟骨增生活躍，染色陽性比例明顯升高，2組軟骨缺損修復(fù)作用均較明顯，且軟骨-KLPP組較軟骨-KLD-12組更加明顯（P<0.05）。與軟骨組比較，軟骨-KLD-12組和軟骨-KLPP組Col-Ⅰ、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ的相對表達(dá)水平均明顯增加（P<0.05），且軟骨-KLPP組較軟骨-KLD-12組增加更顯著（P<0.05），見圖5、6。
3 討論
關(guān)節(jié)軟骨損壞后的自我修復(fù)能力非常有限，若不及時(shí)治療，即使是較小的損傷也會隨著時(shí)間的推移發(fā)展成更嚴(yán)重的病變，最終導(dǎo)致整個(gè)關(guān)節(jié)的退變和骨關(guān)節(jié)炎[8]。目前，軟骨缺損提倡階梯治療，即根據(jù)疾病的不同發(fā)展階段選擇不同的治療方式，包括降低體質(zhì)量、補(bǔ)充營養(yǎng)、鍛煉、使用藥物和外科手術(shù)治療等[2]。由于目前保守治療的效果有限，關(guān)節(jié)內(nèi)注射藥物的療效不確切[9-10]，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)仍是治療嚴(yán)重關(guān)節(jié)軟骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)。但人工關(guān)節(jié)假體價(jià)格高昂，增加了醫(yī)療負(fù)擔(dān)，因此，研究新的軟骨修復(fù)手段十分必要。KLPP凝膠與傳統(tǒng)KLD-12凝膠具有相似的納米結(jié)構(gòu)和流變性能。本研究通過自主合成KLPP凝膠，并觀察KLPP凝膠對軟骨缺損的修復(fù)作用，以期為關(guān)節(jié)軟骨缺損提供新的治療策略。
內(nèi)源性干細(xì)胞的原位軟骨再生技術(shù)在軟骨缺損的治療中受到了廣泛關(guān)注，該技術(shù)利用人體自身的再生能力來修復(fù)軟骨組織，避免了外源性細(xì)胞帶來的不利影響[11]。微骨折是關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的常用策略，利用BMSCs分化的原理來使軟骨組織再生。然而，新組織大多是相對較弱的纖維軟骨，而不是透明軟骨。原因可能是招募的干細(xì)胞數(shù)量不足[12]。因此，能夠改善和增強(qiáng)內(nèi)源性干細(xì)胞聚集的化學(xué)誘導(dǎo)劑或生物誘導(dǎo)支架成為了研究焦點(diǎn)[13]。
KLD-12凝膠是目前研究中比較成熟的自組裝納米多肽材料，近幾年已被國外用于內(nèi)源性軟骨細(xì)胞的募集[14]。然而常規(guī)的KLD-12凝膠不能滿足軟骨缺損修復(fù)對BMSCs聚集的高需求[15]。本研究通過使用兩個(gè)甘氨酸(G)殘基作為間隔鏈，將具有軟骨誘導(dǎo)作用的功能基序DHLSDHLSDNYTLDIDRAIH添加到KLD-12的C-末端，從而制造了氨基酸序列為KLDLKLDLKLDLGGDHLS DHLSDNYTLDEDRAIH的功能性納米自組裝多肽KLPP凝膠。這種材料既保留了納米自組裝多肽KLD-12可以自組裝成膠的特性，又具備了可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖的功能，其可以通過微創(chuàng)的方式注入關(guān)節(jié)內(nèi)，并在關(guān)節(jié)內(nèi)提供潤滑及塑型填補(bǔ)軟骨缺損面的作用，在軟骨缺損治療中可能具有較大優(yōu)勢。
為了明確KLPP凝膠在軟骨缺損修復(fù)方面的作用，本研究對比觀察了KLPP凝膠與KLD-12凝膠對BMSCs軟骨分化誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖活力的影響以及對軟骨缺損修復(fù)的作用，結(jié)果顯示，KLPP凝膠可顯著提高軟骨分化后BMSCs的增殖活力，并促進(jìn)BMSCs中軟骨細(xì)胞再生標(biāo)志物Col-Ⅰ、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ的蛋白表達(dá)，而且KLPP凝膠對軟骨細(xì)胞再生標(biāo)志物的促進(jìn)作用明顯大于KLD-12凝膠。Lu等[16]報(bào)道了軟骨細(xì)胞在誘導(dǎo)下可以向周圍組織材料內(nèi)遷移，從而有利于組織工程軟骨的整合。Levinson等[17]將軟骨顆粒嵌入纖維蛋白和膠原蛋白凝膠中，并在培養(yǎng)28 d后觀察到明顯的軟骨細(xì)胞生長。Ng等[9]報(bào)道，在體外軟骨缺損模型中，大孔聚乙烯醇(PVA)支架促進(jìn)了軟骨細(xì)胞從宿主軟骨遷移到支架，并改善了界面整合。這些研究都證明了軟骨細(xì)胞可以遷移進(jìn)入組織工程材料并在材料的支持下更好地促進(jìn)軟骨缺損區(qū)域的修復(fù)。本研究中KLPP凝膠也同樣提供了促進(jìn)軟骨生長的功能序列和支架結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，在KLPP凝膠內(nèi)軟骨細(xì)胞生長明顯優(yōu)于對照組。因此，我們認(rèn)為KLPP凝膠具有較好的促進(jìn)軟骨分化和軟骨細(xì)胞生長的作用。另外，本研究證實(shí)了KLPP凝膠與KLD-12凝膠具有相似的細(xì)胞毒性，均可以良好地支持保護(hù)軟骨細(xì)胞的生長。為進(jìn)一步驗(yàn)證KLPP凝膠的軟骨缺損修復(fù)作用，本研究利用臨床軟骨組織標(biāo)本，建立軟骨缺損軟骨片，經(jīng)過長期的KLPP凝膠治療發(fā)現(xiàn)，KLPP凝膠具有較好的軟骨修復(fù)、界面整合和軟骨再生作用，且效果強(qiáng)于KLD-12凝膠。我們推測這與KLPP凝膠具備了較好的軟骨細(xì)胞增殖誘導(dǎo)功能以及較好的軟骨細(xì)胞和BMSCs的募集功能密切相關(guān)。進(jìn)一步檢測軟骨細(xì)胞標(biāo)志物Col-Ⅰ、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在軟骨缺損治療中KLPP凝膠對軟骨細(xì)胞標(biāo)志物Col-Ⅰ、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ表達(dá)的促進(jìn)作用大于KLD-12凝膠；而未經(jīng)治療的軟骨缺損并未愈合，且其中主要以纖維組織或纖維軟骨為主。因此，KLPP凝膠是一種極具潛力的軟骨缺損修復(fù)候選者。
綜上所述，功能性納米自組裝多肽KLPP凝膠可促進(jìn)BMSCs細(xì)胞軟骨分化后的細(xì)胞活力，修復(fù)受損的透明軟骨并促進(jìn)其再生，改善軟骨缺損區(qū)域的界面整合。因此，KLPP凝膠將是一種很有前途的軟骨再生的候選者，不需要任何外來細(xì)胞或化學(xué)引誘劑。
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