摘要：眾所周知，線粒體是細胞的動力源，也是一些重要信號通路的啟動器。多種疾病被發(fā)現(xiàn)與線粒體的異常有關(guān)，包括癌癥。因此，針對線粒體及其代謝被認為是治療癌癥的有希望的方法。近年來，人們致力于開發(fā)針對線粒體的藥物，包括小分子藥物、肽、蛋白質(zhì)和基因，已有多種分子藥物和肽進入臨床試驗。隨著納米技術(shù)的進步，集生物標志物靶向、刺激反應(yīng)、自組裝和治療效果于一體的自組裝肽納米材料在生物技術(shù)和納米醫(yī)學領(lǐng)域引起了越來越多的關(guān)注。特別是，原位線粒體靶向自組裝肽可以在線粒體表面或內(nèi)部組裝，為線粒體靶向癌癥治療開辟了另一個維度。本文重點介紹線粒體靶向肽納米材料的最新進展，尤其是線粒體原位自組裝系統(tǒng)，以及它們在癌癥治療中的應(yīng)用。
介紹：線粒體是哺乳動物細胞中的動態(tài)亞細胞器，眾所周知，它參與三磷酸腺苷 (ATP) 的生成。它們由線粒體膜組成，包括多孔的外膜和具有空間的內(nèi)膜，以及內(nèi)部的線粒體基質(zhì) 。線粒體擁有自己的基因組和裂變特征，還參與體內(nèi)其他重要的生理功能，如大分子生物合成 和細胞增殖 、分化 (線粒體參與細胞凋亡、信息傳遞等過程。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙與一系列威脅人類健康的疾病有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和癌癥。越來越多的證據(jù)揭示了線粒體的能量產(chǎn)生、代謝生物合成和單一途徑與癌變之間的相關(guān)性。因此，線粒體被認為是改善癌癥治療的一個有希望的靶點。
目前，對線粒體的干預可以通過使用線粒體靶向試劑或調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)或外的特定靶點、基因轉(zhuǎn)錄和激酶活性來進行。特別是隨著多種靶向化合物的發(fā)現(xiàn)，線粒體靶向方法受到越來越多的關(guān)注。例如，首次發(fā)現(xiàn)親脂性陽離子，如三苯基膦 (TPP) 和地喹啉 (dequalinium) 可以靶向線粒體。TPP 含有一個帶正電的磷原子，該磷原子離域于三個疏水苯環(huán)上。由于TPP具有獨特的結(jié)構(gòu)，因此它能夠利用負的膜電位和穿過磷脂雙層時有利的活化能來靶向線粒體膜，從而使線粒體積累增加數(shù)千倍。到目前為止，兩種基于TPP的小分子抗氧化劑MitoQ和SkQ1已分別用于治療帕金森病、慢性腎病和丙型肝炎以及干眼癥的臨床試驗；第二類是線粒體靶向肽，主要包括Szeto-Schiller（SS）肽和線粒體穿透肽（MMPs）。這些肽通常由疏水性和帶正電荷的氨基酸組成，它們被認為是通過負膜電位和與線粒體內(nèi)膜上磷脂的相互作用來靶向線粒體的。SS肽（MTP-131）的一種制劑已在臨床試驗中用于治療老年人心臟病發(fā)作和骨骼肌線粒體功能障礙。此外，線粒體前體蛋白是一種天然的線粒體靶向物種，它通過線粒體蛋白質(zhì)進口機制進入線粒體。這些蛋白質(zhì)含有可切割的N末端靶向序列，一旦進入線粒體，就會被線粒體肽酶切割，近年來，自組裝肽納米材料因其可設(shè)計的特點，將靶向性、生物響應(yīng)性、自組裝性和治療性結(jié)合起來，成為一種新型的線粒體靶向材料
本文主要介紹近年來開發(fā)的靶向線粒體的自組裝肽納米材料，重點介紹構(gòu)建靶向線粒體并在線粒體中組裝的自組裝肽的最新策略和進展，包括靶向線粒體的配體的裝備、引入刺激響應(yīng)機制以原位觸發(fā)自組裝等，并簡要討論了這些納米材料在癌癥治療中的應(yīng)用。
自組裝肽
用于靶向線粒體的自組裝肽納米材料
構(gòu)建線粒體靶向自組裝肽的典型方法是將靶向基序裝備到自組裝肽上。例如，Standley 等人將 α-螺旋 (KLAKLAK) 2 (KLAK) 肽（一種破壞線粒體膜的細胞毒性肽）與疏水烷基尾巴和 β-折疊形成肽相結(jié)合，得到線粒體靶向肽兩親物）。這種肽兩親物可以組裝成納米纖維，經(jīng)證實可進入乳腺癌細胞，然后定位并破壞線粒體膜。為了提高靶向效果，利用內(nèi)源性酶、氧化還原和酸性環(huán)境以及外源性光和超聲波等刺激來引導靶向自組裝。例如，Wang 等人報道了一種堿性磷酸酶 (ALP) 指導的自組裝肽，用于靶向線粒體。該肽由線粒體靶向基序 (TPP)、自組裝骨架 (FFYK)、酶反應(yīng)性磷酸化酪氨酸和熒光團 (NBD) 組成。在癌細胞膜上過表達的 ALP 去磷酸化后，該肽變得更疏水并自組裝成納米纖維。在內(nèi)吞和內(nèi)體逃逸后，肽組裝體在 TPP 的幫助下積累到線粒體中，導致線粒體功能障礙和細胞死亡。值得注意的是，在實驗濃度下，該肽在低 ALP 表達的 HS-5（正常人骨髓基質(zhì)）細胞中沒有形成組裝體。
盡管在培養(yǎng)細胞中取得了成功，但自組裝肽仍然面臨著生理環(huán)境中不穩(wěn)定性的問題，以及在體內(nèi)應(yīng)用時存在的一些生理障礙，如血液中的快速清除、不受控制地運輸?shù)交疾〗M織、細胞內(nèi)化不充分和內(nèi)體逃逸等。為了提高體內(nèi)的生物學性能，Wang 等人報道了一系列聚合物-肽綴合物（PPC）作為體內(nèi)自組裝納米藥物。例如，Cong 等人報道了一類靶向腫瘤線粒體的PPC，其血液循環(huán)時間長。PPC 由聚（β-硫酯）骨架和側(cè)鏈上用 pH 可裂解的順烏頭酸酐 (CAA) 部分和細胞穿透肽 (TAT: CYGRKKRRQRRR) 修飾的 KLAK 肽組成。全身給藥后，親水性 PPC 仍然可作為單體溶解，從而可以在血流中長時間循環(huán)并深入實體腫瘤。到達腫瘤組織后，酸性腫瘤微環(huán)境會觸發(fā) PPC 上親水性 CAA 部分的裂解，從而形成裝飾有 KLAK 和 TAT 肽的 100 納米大小的納米粒子。這些新形成的納米粒子在 TAT 肽的幫助下進入癌細胞，然后進一步定位線粒體并誘導與 KLAK 肽相關(guān)的細胞凋亡。
肽納米材料在線粒體中的原位自組裝
在上一節(jié)中，我們討論了定位線粒體的組裝肽納米材料。最近，原位自組裝因其時空精度和可激活的生物效應(yīng)而備受關(guān)注，成為生物醫(yī)學領(lǐng)域的一個前沿。特異性酶和過表達的ROS可用于原位觸發(fā)線粒體周圍或表面的自組裝。如圖1B所示，He等報道了一種線粒體腸激酶（ENTK）指導的分支肽，用于在線粒體周圍自組裝。親水性 ENTK 可切割的 Flag-tag (DDDDK) 被結(jié)合到肽支架上，形成膠束狀結(jié)構(gòu)。細胞內(nèi)化后，由于 ENTK 的酶促切割，膠束主要在線粒體處轉(zhuǎn)化為納米纖維。這種自組裝肽的構(gòu)建已成功將氯霉素和組蛋白 (H2B) 遞送到體外癌細胞的線粒體。此外，為了實現(xiàn)體內(nèi)的線粒體靶向性，Cheng 等人構(gòu)建了一種由 ROS 觸發(fā)的形態(tài)可轉(zhuǎn)化的 PPC，由聚乙二醇 (PEG) 鏈的響應(yīng)性分離驅(qū)動。PPC 由聚乙烯醇骨架組成，側(cè)鏈修飾有 PEG 化 KLVFF 肽，這些肽由 ROS 可裂解的硫縮酮和 KLAK 肽連接。給藥后，膠束狀 PPC 在 PEG 鏈的保護下在血流中運輸。一旦靠近線粒體，過量產(chǎn)生的 ROS 會裂解硫縮酮連接基，從而分離 PEG 鏈，導致膠束轉(zhuǎn)化為納米纖維，從而使 KLAK 肽暴露，從而破壞線粒體膜。
為了進一步實現(xiàn)肽段在線粒體內(nèi)的精準自組裝，靶向聚集誘導組裝和線粒體內(nèi)蛋白酶誘導組裝表現(xiàn)出良好的潛力。由于足夠濃度高于臨界聚集濃度（CAC）是分子組裝的基礎(chǔ)，因此選擇性地制備線粒體中空間濃度高于CAC、細胞質(zhì)中空間濃度低于CAC的自組裝肽段是實現(xiàn)線粒體原位自組裝的一種可行方法。例如，Jeena等人報道了一種通過靶向聚集誘導組裝在線粒體內(nèi)進行組裝的原位自組裝系統(tǒng)（Mito-FF）（圖1C）Mito-FF 由 FFK 肽骨架、N 端熒光芘和賴氨酸側(cè)鏈 TPP 組成，CAC 為 60 µM。使用含有 5 µM 和 10 µM Mito-FF 的培養(yǎng)基，兩親性 Mito-FF 可以有效且選擇性地聚集在宮頸癌 (HeLa) 細胞的線粒體內(nèi)，濃度分別為 3 mM 和 11 mM，從而原位聚集成線粒體內(nèi)的納米纖維。除了靶向積累誘導聚集外，Yang 等人最近利用線粒體定位酶 sirtuin 5 (SIRT5)原位誘導線粒體內(nèi)肽自組裝（圖 1D）2020該多肽以FFFGKG為骨架，N端帶有熒光探針NBD，并帶有琥珀�；馁嚢彼釟埢�，進入線粒體后，被SIRT5去琥珀�；�，疏水性增強，從而導致線粒體內(nèi)形成納米纖維。
癌癥治療中的應(yīng)用
為了實現(xiàn)線粒體細胞毒肽以改善癌癥治療，Qiao 等人開發(fā)了一種含有通過 Michael 型加成制備的 KLAK 肽的 PPC。這種合成方法可以將靶向肽和治療肽與 PEG 鏈輕松地結(jié)合到聚合物骨架上，從而實現(xiàn)了對皮下膠質(zhì)母細胞瘤 (U87) 小鼠模型的改善的生物穩(wěn)定性和增強的抗癌功效。然而，這種共價方法存在反應(yīng)時間長（例如 2 天）和硫醇和胺基競爭反應(yīng)的問題。為了構(gòu)建一種快速簡便的肽藥物全身遞送方法，Wang 等人基于非共價超分子化療的概念，提出了一種超分子肽治療策略。由于葫蘆[7]脲（CB[7]）與肽中的N末端苯丙氨酸（N-Phe）殘基之間存在強的主客體相互作用（結(jié)合常數(shù)∼2 × 10 6 M −1)，以簡單（在水溶液中混合）和快速（幾分鐘）的方式將含有 N-Phe 的 KLAK 肽負載在 CB[7]-PEG 共聚物上，在 0.5 mM 肽濃度下具有較高的肽包封率 (>97%)。該策略通過延長血液循環(huán)時間（靜脈注射后 1 小時殘留 25%，而單獨的肽殘留 13%）、增強腫瘤蓄積（增強 2.8 倍）和增強抗癌效果（腫瘤抑制率增強 4 倍）對皮下結(jié)腸直腸腫瘤 (HCT116) 小鼠模型靜脈注射，血液學、肝臟和腎臟毒性最小。此外，為了克服癌細胞的耐藥性，同一研究小組進一步將奧沙利鉑與協(xié)同破壞 ATP 生成的 KLAK 肽結(jié)合，在酸觸發(fā)的按需藥物釋放系統(tǒng)中（圖 1E），實現(xiàn)了對奧沙利鉑耐藥 HCT116 細胞的抗癌活性增強，IC 50從 76.5 µM（奧沙利鉑）降低到 31.2 µM（Wang H. et al., 2021）除了化療外，Zhang等人利用近紅外光的光熱效應(yīng)，促進含紅紫素-18肽的自組裝，使自組裝速率提高了4倍，在腫瘤中的蓄積提高了2倍。
結(jié)論與展望
納米技術(shù)和生物技術(shù)的進步見證了自組裝肽從簡單的水凝膠支架到用于多種生物醫(yī)學應(yīng)用的智能納米材料的巨大進步，彌補了簡單的合成分子與體內(nèi)復雜的生物機械之間的差距。由于具有包括優(yōu)異的生物相容性和對多種生物和物理化學活性的包容性等優(yōu)勢，自組裝肽實現(xiàn)了從組織、細胞到細胞器水平的自組裝精度。然而，針對線粒體的自組裝肽的進一步發(fā)展仍然存在一些挑戰(zhàn)。首先是精確的自組裝。除了膜電位、酶和ROS之外，其他候選蛋白包括線粒體蛋白質(zhì)輸入機制和核酸，也是有希望的目標。第二個是原位表征。高分辨率、實時、原位技術(shù)對于研究細胞器自組裝的過程和動力學非常有價值。第三是快速設(shè)計和篩選。機器學習技術(shù)可以提供一種高通量的方法來開發(fā)配備多個生物活性和功能模塊的自組裝肽。最后但并非最不重要的是，生物安全性應(yīng)該受到高度關(guān)注。由于肽納米纖維的長期保留特性，仔細研究自組裝肽的降解、代謝和長期毒理學對于其進一步的臨床應(yīng)用非常重要。盡管面臨挑戰(zhàn)，我們相信自組裝肽納米材料，特別是細胞器精確的自組裝肽，將有助于生物醫(yī)學技術(shù)和產(chǎn)品的新范式。
免責聲明：本文為行業(yè)交流學習，版權(quán)歸原作者及原雜志所有，如有侵權(quán)，可聯(lián)系刪除。文章標注有作者及文章出處，如需閱讀原文及參考文獻，可閱讀原雜志。
