前言：細胞穿透肽 (CPP) 是短肽（少于 30 個氨基酸），過去 30 年來主要用于基礎和臨床前研究。由于它們不僅能夠轉運到細胞中，還能促進藥物或 CPP/貨物復合物轉運到質膜，因此它們在疾病診斷和治療方面具有潛在應用，包括癌癥、炎癥、中樞神經系統(tǒng)疾病、耳科和眼科疾病以及糖尿病。然而，美國食品藥品管理局 (FDA) 尚未批準任何 CPP 或 CPP/貨物復合物。在將 CPP 轉化為臨床之前，應該解決許多問題。在這篇評論中，我們總結了基于使用 CPP 改善遞送的臨床前研究和臨床試驗的最新發(fā)展和創(chuàng)新，這表明 CPP 或基于 CPP 的遞送系統(tǒng)具有出色的診斷治療遞送潛力。
成功的系統(tǒng)性藥物給藥通常包括一系列步驟，例如長循環(huán)、穿透生物屏障、受體細胞吸收以及內吞后內體逃逸到細胞質空間，每個步驟都有各自的限制。事實上，許多生物活性分子難以接近靶標，并穿透細胞膜以達到治療效果。由于質膜作為有效的生化屏障，它們在防止外源性入侵方面發(fā)揮著關鍵作用。例如，肽和寡核苷酸已在各種治療研究中得到廣泛評估，但它們的跨膜效率往往相對較低，因此，在治療部位達到所需的藥物濃度具有挑戰(zhàn)性。目前用于遞送大分子的策略包括納米顆粒、脂質體、病毒載體、微注射和電穿孔，可能導致高毒性、特異性差、免疫原性以及低遞送效率和功效。因此，迫切需要一種高效、有效的將大分子遞送到靶細胞的方法。
一般認為親水性大分子只能通過經典的內吞途徑被細胞吸收，然而一些具有膜穿透功能的多肽可以通過能量非依賴的途徑將親水性大分子轉運到真核細胞中。它們被稱為細胞穿透肽（CPP），又稱蛋白轉導結構域（PTD），是一類短肽（不超過30個殘基），主要用于癌癥、炎癥、中樞神經系統(tǒng)疾病、耳部保護、眼部疾病和糖尿病等疾病診斷和治療的基礎和臨床前研究中。它們不僅能夠轉運小分子藥物、核酸、蛋白質、病毒、成像劑跨質膜運輸，但也允許 CPP/貨物復合物通過不同的內吞途徑運輸?shù)郊毎ね�，具體取決于 CPP 的類型 。與上述其他遞送策略不同，CPP 可以以非侵入性的方式進入細胞，因為它們通常不會擾亂質膜的結構，并且被認為是安全且高效的。CPP 于 1988 年由兩個研究小組首次引入 。Frankel等人和Green等人都觀察到HIV轉錄激活因子(TAT)蛋白能夠進入組織培養(yǎng)細胞，靶向進入細胞核，最終導致目的基因表達。1991年，Joliot等人發(fā)現(xiàn)觸角足同源結構域(pAntp)，一個由60個氨基酸組成的合成肽，能夠被神經細胞內化。隨后，Derossi等人在觸角足同源結構域第三螺旋(RQIKIYFQNRRMKWKK)中發(fā)現(xiàn)了一個由16個氨基酸組成的短肽，命名為穿透素，能夠穿透質膜。此后，各種CPPs相繼從天然來源和合成來源被鑒定。
CPPs 已成功應用于不同類型的藥物、納米顆粒和脂質體的遞送，用于疾病的診斷和治療。盡管基于 CPP 的臨床試驗數(shù)量已大大增加，但事實上，美國食品藥品管理局 (FDA) 尚未批準任何 CPP 或 CPP/貨物復合物。在這篇綜述中，我們將系統(tǒng)地總結過去 5 年 CPPs 在各種疾病診斷和治療中的最新應用策略，并強調 CPPs 的臨床前研究和臨床應用。我們提出了 CPPs 的分類，并解釋了這些肽的細胞攝取機制。我們將討論 CPPs 在臨床應用中的不足和局限性�；卮疬@些問題將使我們能夠開發(fā)更有效的藥物遞送系統(tǒng)。最后，我們將討論CPP在不同疾病診斷和治療中應用的各種新策略。
CPPs的分類
根據(jù)來源分類
根據(jù)形態(tài)分類
根據(jù)構象不同，CPPs可分為線性CPPs和環(huán)狀CPPs。目前許多研究證實，環(huán)狀CPPs相較于線性CPPs具有諸多優(yōu)勢。與線性CPPs相比，環(huán)狀CPPs具有更高的細胞通透性，與細胞上靶受體的親和力更高，從而通過受體介導的攝取進一步提高跨膜能力。此外，線性CPPs通常對蛋白水解敏感，導致體內藥代動力學性質較差，而環(huán)狀CPPs一般對蛋白水解有較高的抵抗力，同時，一些環(huán)狀CPP無需經過內體降解即可被吸收，并具有靶向細胞核的特性
根據(jù)理化性質分類
根據(jù)理化性質的不同，CPPs可分為陽離子CPPs、兩親性CPPs和疏水性CPPs三類。在正常生理pH條件下，陽離子CPPs帶正電荷，與細胞質膜有很好的親和力，陽離子CPPs通過靜電作用與帶負電荷的細胞膜糖蛋白結合，通過不依賴受體的機制內化到細胞內。影響陽離子CPPs活性的關鍵因素是CPP結構中帶正電荷的精氨酸的數(shù)量和位置，大多數(shù)陽離子CPPs通常含有5個以上帶正電荷的氨基酸。聚精氨酸片段的細胞攝取能力最高，具有治療潛力。研究結果表明，寡精氨酸的內化能力隨其長度增加而增加，但就遞送目的而言，最佳長度為R8至R10。過高的值會對細胞產生不可逆的副作用，并降低整體遞送效率。核定位信號（NLS）是一種富含精氨酸、賴氨酸或脯氨酸的小肽，常見于CPP中。NLS可通過經典的核引入途徑轉運到細胞核中，由于NLS所帶正電荷有限、穿透膜能力有限，因此常將其與疏水性或兩性氨基酸序列結合，制成有效、多功能的兩親性載體，包括MPG和Pep-1。
目前發(fā)現(xiàn)的CPP中，兩親性CPP最為常見，占比超過40%。兩親性CPP含有極性和非極性氨基酸區(qū)，非極性區(qū)富含疏水性氨基酸（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等）。一些兩親性CPP完全來源于天然蛋白質，如pVEC、ARF（19–31）。ARF（19–31）來源于腫瘤抑制基因p14ARF蛋白（19–31）的N末端結構域。通過兩親性CPP將疏水片段和 NLS 部分共價結合而獲得的嵌合肽，例如 Pep1 (KETWWETWWTEWSQPKKRKV)、MPG (GLAFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV) 均基于 SV40 NLS (PKKRKV) 。先前的研究表明，同一種兩親性CPP可能具有不同的二級結構，其與疏水/親水界面的結合能力在不同條件下可能會發(fā)生變化。兩親性CPP，如MAP，能與帶負電荷的磷脂發(fā)生強烈的相互作用，具有α螺旋結構的MAP會自發(fā)插入到脂質單層中。此外，肽/脂相互作用的結構分析表明，具有β-折疊結構的MPG比α-螺旋結構的MPG對電荷更敏感。
疏水性CPP數(shù)量相對較少，其結構中含有大量非極性殘基或者僅含有少量帶電氨基酸（不足序列的20%）。目前發(fā)現(xiàn)的天然疏水性CPP包括C105Y、Bip4和K-FGF。與已知的大多數(shù)兩親性陽離子CPP不同，疏水性CPP的肽序列對細胞攝取沒有顯著影響。
CPP 的細胞攝取機制
直接轉運
直接轉運又稱非內吞吸收途徑，是一種能量依賴性轉運方式。直接轉運最初通過磷脂雙層與 CPP 或 CPP/貨物之間的靜電相互作用或氫鍵作用進行，隨后CPP 或 CPP/貨物通過成孔或膜不穩(wěn)定作用進入細胞。根據(jù)轉導機制不同，直接轉運主要分為三種模式：“Barrel-Stave”模式、“Carpet-like”模式和反膠束模型，如圖 2所示。
基于成孔的“桶狀-壁狀”模型中，兩親性CPP或CPP/貨物插入細胞膜，其疏水區(qū)與細胞膜中的磷脂結合，而其親水區(qū)與磷脂的親水頭結合，形成“桶狀”孔道，跨膜運動增強，隨后CPP被運送到細胞質中。而反膠束模型則依賴于磷脂雙層的內陷和反膠束的形成，在此過程中，帶電的CPPs或CPP/cargoes殘基與細胞表面的磷脂結合，CPPs或CPP/cargoes的疏水區(qū)與細胞膜相互作用，形成倒膠束，進而通過倒膠束將CPPs或CPP/cargoes轉運到細胞內。但值得一提的是，倒膠束模型適用于帶有疏水性氨基酸殘基的CPPs或CPP/cargoes。在“Carpet-like”模型中，CPPs或CPP/cargoes是通過CPPs與細胞膜之間的電荷相互作用轉運到細胞內的，CPPs或CPP/貨物像地毯一樣覆蓋在細胞膜表面，其疏水部分與細胞膜的疏水區(qū)相互作用。當CPPs或CPP/貨物濃度較高時，其疏水部分會被細胞膜疏水核心翻轉，細胞膜流動性增加。最終，細胞膜被破壞，CPPs或CPP/貨物被運輸?shù)郊毎麅�。但直接轉運最適合與小分子貨物相關的CPPs或CPPs進入細胞，大分子量的CPPs或CPP/貨物主要依靠內吞作用進入細胞。
內吞作用
除了直接轉運攝取外，CPPs 或 CPP/貨物還可以通過內吞作用轉運到細胞中。研究表明，能量依賴性內吞作用是大分子量 CPPs 或 CPP/貨物的主要細胞攝取機制。到目前為止，四種不同的途徑已被用于描述內吞作用，包括巨胞飲作用、caveolin 介導的內吞作用、網格蛋白介導的內吞作用以及網格蛋白和 Caveolin 獨立的內吞作用，示意圖也顯示在圖 1。
基于受體非依賴性和脂筏依賴性的巨胞飲作用是攜帶大分子貨物的CPPs優(yōu)先選擇的內吞途徑。在生長因子的誘導和肌動蛋白的刺激下，CPP/貨物可以通過成熟的囊泡轉移到細胞內。巨胞飲作用下的細胞攝取過程如下：首先，CPP/貨物與膜蛋白聚糖相互作用，激活胞漿中的rac蛋白，rac蛋白發(fā)出信號觸發(fā)F-肌動蛋白組織，肌動蛋白微絲收縮，細胞膜變形、突起，形成內吞囊泡，最后CPP/貨物被內吞進入細胞，網格蛋白介導的內吞作用又稱受體介導的內吞作用，是細胞特異性地攝取細胞外物質的過程。CPP/貨物首先附著在細胞膜上的受體上，epsin蛋白與細胞膜相互作用后產生彎曲，隨后通過募集網格蛋白和異四聚體蛋白（AP-2）形成小窩，并發(fā)展成含有CPP/貨物的網格蛋白包被的囊泡，隨后在細胞質中形成內體。而caveolin介導的內吞作用與網格蛋白介導的內吞作用類似，但與caveolin有關。在此過程中，CPP/cargoes會特異性地識別脂筏上的受體，脂筏是富含膽固醇和鞘磷脂的疏水區(qū)。Cavin-1與caveolin連接，隨著cavin-1和caveolin復合物數(shù)量的逐漸增加，小坑形成并內陷。得到caveolin包裹的囊泡，形成內體。此外，還有一條不依賴網格蛋白和caveolin的內吞途徑，主要發(fā)生在巨噬細胞等特殊細胞中。CPP/cargoes可被調理素識別和標記，并附著在細胞膜上的Fc受體上，當肌動蛋白受到刺激時，產生包裹在細胞膜上的CPP/cargoes，隨后CPP/cargoes被轉位到細胞質中。雖然能量依賴性的內吞作用是CPP/cargoes進入細胞的主要途徑，但CPP/cargoes始終包裹在內體中，難以發(fā)揮其生物活性。因此，為了避免被溶酶體降解，CPP/cargoes必須逃離內體。有研究表明，pH梯度的形成、囊泡濃度的增加以及帶不同電荷的內體膜與CPPs的吸引均導致膜變硬和破裂，導致CPP/cargoes逃離內體。然而，這仍然是一個挑戰(zhàn)。
CPP在多種疾病診斷和治療中的應用
CPP在癌癥治療中的應用
大部分CPPs帶有正電側鏈，與細胞膜上高密度的陰離子電荷相互作用。不同長度的聚精氨酸在藥物遞送中被廣泛應用。CPPs的陽離子電荷密度是影響藥物轉染效率的重要參數(shù)。Favaro等利用大腸桿菌設計了四種聚精氨酸融合的綠色熒光蛋白（R3-GFP-H6、R6-GFP-H6、R7-GFP-H6、R9-GFP-H6 ）生物制備。帶不同電荷的聚精氨酸尾部影響GFP變體的折疊狀態(tài)，R7-GFP-H6、R9-GFP-H6可以在Tris葡萄糖緩沖液中自組裝形成納米顆粒。在與HeLa細胞孵育的早期階段，單分子R3-GFP-H6、R6-GFP-H6、R7-GFP-H6通過CXCR4受體的細胞攝取隨精氨酸殘基數(shù)的線性增加而提高。當R7-GFP-H6組裝納米顆粒時，穿透性高于游離R7-GFP-H6。多價陽離子精氨酸增加了納米顆粒的攝取，多聚化可以進一步增加內化效果。游離Rn-GFP-H6主要通過CXCR4依賴性途徑進行內吞，寡聚化狀態(tài)轉換為受體獨立的攝取機制。CPPs 的內化能力也與貨物狀態(tài)有關 。此外，Kadonosono等發(fā)現(xiàn)NRP1結合也能促進CPP/PTD外滲。CPP也被用來介導細胞對除蛋白質和納米顆粒以外的細胞外囊泡的攝取。用聚精氨酸修飾細胞外囊泡，通過誘導主動微胞飲作用來提高內化率，精氨酸殘基的數(shù)量影響有效的細胞內化率。十六肽精氨酸（R16）修飾的細胞外囊泡表現(xiàn)出相對有效的抗癌活性。
一般而言，線性結構的CPPs由于電荷數(shù)低，很難獲得令人滿意的寡核苷酸轉染效率，導致納米載體的絡合性較差，結構不穩(wěn)定。Yoo等利用二硫鍵合成了支鏈狀的R9，并進一步以R9為載體構建了一種新型的生物可還原陽離子網絡（B-mR9），支鏈結構對pDNA或siRNA具有強大的靜電吸附能力。B-mR9在體外表現(xiàn)出良好的生物相容性和細胞內運輸能力。此外，B-mR9 通過長達 48 小時的 EPR 效應表現(xiàn)出對腫瘤的特異性靶向作用。與對照組相比，B-mR9/siVEGF 顯著抑制了 56.5% 的腫瘤生長，在 NCI-H460 荷瘤 BALB/c 裸鼠模型中的治療效果優(yōu)于 PEI25k 和 R9 載體。CPP 衍生的陽離子網絡為設計基因遞送平臺提供了一種新方法。Wang 等人還利用基于 Chol 的 CPP 組裝了一種 pH 敏感、生物相容性的膠束體系，該系統(tǒng)可以共同遞送 ULK1 siRNA 和 AMPK 激活劑水環(huán)克拉辛，在臨床前研究中通過調控程序性細胞死亡有效抑制肝細胞癌。近期研究證實 CPP 將成為 siRNA 寡核苷酸的新范式。
由于正電荷會引起非靶標毒性和全身毒性，CPPs 的臨床應用范圍較窄。陽離子或兩親性 CPPs 的穿透能力通常比中性 CPPs 更強。Gao 等人發(fā)現(xiàn)了一種新型的具有電中性的高疏水性環(huán)狀 CPPs (環(huán)孢菌素 A，CsA)，其在 MCF-7 細胞中的穿透能力比 PFV (PFVYLI) 和五肽 VPT (VPTLQ) 高出數(shù)倍，比傳統(tǒng)的中性 CPPs 更有效。通過遞送膜不可穿透的促凋亡肽 (PAD)，將環(huán)孢菌素 A 的效率和毒性與 TAT 進行了比較。當 CsA 與 PAD 結合時，在用 CsA 測試的腫瘤細胞系中 PDA 的攝取提高了 2.2 到 4.7 倍，并且 CsA-PAD 的細胞攝取通常高于 TAT-PAD。CsA-PAD 在四種不同的腫瘤細胞系中的細胞毒性與 TAT-PAD 相似或更強，具體取決于細胞類型，但明顯強于 PAD。在異種移植 MCF-7 裸鼠模型中，CsA-PAD 表現(xiàn)出與 TAT-PAD 相當?shù)目鼓[瘤活性，但全身毒性降低。電中性 CPP 可能具有更好的潛在應用價值體內分布優(yōu)于陽離子CPP，但中性CPP的準確組織分布有待進一步評估，另一降低正向CPPs毒性和非靶向性的策略是利用多聚陰離子材料包裹納米粒子，如透明質酸（HA），它是腫瘤表面特異性過表達標志物CD44的高親和力配體。Zhao等制備了TAT和HA修飾的多功能脂質體用于遞送10-HCPT治療肝細胞癌（HA/CPPs-10-HCPT-NPs），利用低強度聚焦超聲精確控制藥物在腫瘤組織中的釋放。HA修飾后脂質體的Zeta電位由+45.5mV逆轉為-6.55mV。TAT修飾后脂質體的穿透深度在多細胞腫瘤球模型中提高了2.76倍。超聲輔助下脂質體聯(lián)合應用HA和CPPs對肝癌的抑瘤率明顯高于其他組。HA 包覆納米載體是 CPPs 應用的一個有價值且有前景的策略體內。
腫瘤治療的主要挑戰(zhàn)是預后不良，尤其是胰腺癌、神經膠質瘤和淋巴轉移。難治性腫瘤的療效缺乏重大進展，因為遞送系統(tǒng)無法克服復雜的腫瘤微環(huán)境，將藥物遞送到治療部位。CPP 可用作藥物深入腫瘤的分子驅動器。胰腺導管腺癌 (PDAC) 的腫瘤基質中含有豐富的膠原纖維，可抵抗藥物滲透。Lo 等人嘗試解決 PDAC 中的靶標和腫瘤基質滲透挑戰(zhàn)，合成了兩種串聯(lián)肽 (pTP-PEG-iRGD 和 pTP-iRGD) 以制備用于 siRNA 全身遞送的混合膠束。它可以有效繞過PDAC的遞送障礙，在三維類器官和原發(fā)性腫瘤模型中實現(xiàn)腫瘤穿透。此外，混合膠束復合的siRNA顯著延緩了腫瘤的生長。CPPs可誘導貨物穿過血腦屏障（BBB）用于治療膠質瘤。Liu等還制備了陰離子隨機卷曲多肽（PLG）包被的CPPs（PVBLG-8）膠束來運輸針對膠質瘤的siRNA。PLG與PVBLG-8 / siRNA復合物纏結以在血清中獲得穩(wěn)定的結構，并將膠束的表面電位反轉為負電荷。此外，膠束可以響應腫瘤細胞外微環(huán)境中的低pH值，從而發(fā)揮PVBLG-8的細胞穿透功能。在膠質母細胞瘤腫瘤球體和U-87 MG異種移植小鼠模型中，該載體比幾種商業(yè)轉染試劑（如聚（L-賴氨酸）（PLL）或Lipofectamine 2000）表現(xiàn)出優(yōu)異的治療優(yōu)勢.為了進一步提高CPPs在膠質瘤應用中的靶向性，將CPPs與膠質瘤歸巢肽結合以特異性地轉運siRNA。通過共價結合和非共價復合兩種CPPs（PF14，PF28）與靶向肽的結合形式進行優(yōu)化，以提高腫瘤特異性靶向性和基因敲除效果。作者建立了一種非共價復合的PF14：TG1 siRNA遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)對U87細胞具有特異性，其基因沉默效率是PF14的2倍。共價結合的PF32的基因沉默效率明顯低于PF14：TG1，可能是因為CPPs屏蔽了靶向肽與U87 MG受體的相互作用或阻礙了siRNA釋放到胞質中。數(shù)據(jù)表明，靶向肽非共價復合的 CPP 是針對腫瘤進行 siRNA 靶向遞送的可行策略。淋巴轉移是腫瘤播散的重要途徑，鄰近淋巴結是腫瘤最初轉移的部位，并進一步延伸至全身。目前針對淋巴轉移的治療主要通過由于血淋巴屏障的存在，靜脈注射卡巴他賽納米粒子的非靶向性和穿透能力較差。R9修飾的卡巴他賽納米粒子（R9-CN）粒徑為13nm，帶微量正電荷，經證實靜脈注射后具有明顯的淋巴靶向性和深層穿透作用，可用于抗轉移治療。R9-CN的熒光信號在原發(fā)腫瘤部位至少維持24小時的高水平。在乳腺癌淋巴轉移模型中，R9-CN顯著抑制了1.4倍的腫瘤生長速度，對肺轉移的抑制率為63.3%。CPPs修飾納米粒子是一種有效的抗轉移平臺，具有深層淋巴穿透性。
CPP 在炎癥中的應用
CPP 在中樞神經系統(tǒng)疾病中的應用
CPP 是治療帕金森病的有效藥物腦內遞送工具。Kang 等利用 TAT 和線粒體靶向序列 (YGRKKRRQRRRLLRAALR-KAAL) 合成了一種融合 CPP，命名為 CAMP，并用它將抗氧化蛋白人類金屬硫蛋白 1A (hMT1A) 遞送到線粒體中，靶向 ROS 損傷，以預防帕金森病。CAMP-hMT1A能有效挽救帕金森病小鼠模型的運動障礙。Kim等構建了一種PEP-1-PON1融合蛋白，將PON1轉導到細胞中，以防止LDL和HDL氧化引起的炎癥，氧化LDL水平與帕金森病有關。PEP修飾后，神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞和小膠質細胞BV2細胞對PON1的細胞攝取顯著增強。腹腔注射后評估了PEP-1−PON1在體內穿過BBB的遞送能力，通過免疫組織化學觀察PON1在腦內的生物分布。PEP-1−PON1大量聚集在中腦的黑質區(qū)域。然而，未修飾 CPP 的 PON1 未發(fā)現(xiàn)具有腦遞送。PEP-1–PON1 降低了 MMP-9 的表達，并保護多巴胺能神經元免于 MPTP 誘導的小鼠帕金森病模型中的細胞死亡。Ahlschwede 等人構建了殼聚糖修飾的 PLGA 納米顆粒，以延長血漿半衰期并提供針對腦血管淀粉樣蛋白沉積物的靶向能力，用于治療阿爾茨海默病。陽離子血腦屏障穿透肽（K16ApoE）通過物理吸收添加到納米粒子表面，產生血腦屏障轉胞吞作用。在接受 DutchAβ 40 治療的小鼠中，靶向納米粒子的血漿 AUC 比 K16ApoE 靶向納米粒子高約 23 倍。然而，在 K16ApoE 修飾后，靶向納米粒子在 DutchAβ 40 治療小鼠的大腦各個區(qū)域的分布增加了 7 到 9 倍。結果表明，K16ApoE 可以誘導納米粒子在大腦中的積累，從而降低血漿藥物濃度。K16ApoE 修飾的納米粒子顯示出顯著更高的大腦攝取，還可以提供特定的 MRI 對比來檢測大腦淀粉樣斑塊。TAT 也是一種腦滲透性載體，已用于阿爾茨海默病治療。此外，已證明TAT可以與細胞外腦淀粉樣蛋白沉積物的硫酸肝素氨基葡聚糖結合，從而靶向治療阿爾茨海默病。MMP 參與了中風后的神經血管損傷，ACPP 的特洛伊木馬策略可用于中風特異性檢測。陳等人設計了一種明膠酶可激活的 CPP，用于檢測培養(yǎng)原代神經元和體內缺血小鼠腦中的 MMP 活性。R9的細胞穿透功能被陰離子聚谷氨酸屏蔽，它們通過MMP-2/-9裂解肽接頭結合。Cy5結合的ACPP響應中風衍生的MMP的高表達，從而增加中風檢測的細胞攝取。此外，CPP還具有針對中風的神經保護作用，例如聚精氨酸和富含精氨酸的CPP，隨著精氨酸含量的增加功效增強。它們具有減少谷氨酸誘導的神經元鈣內流的能力，以及由硫酸肝素前體聚糖介導的內吞作用誘導所需的神經保護作用。CPP是改善中樞神經系統(tǒng)疾病治療藥物腦輸送的有前途的工具。
CPP 在耳部和眼部保護中的應用
創(chuàng)傷性急性神經性聽力損失越來越受到重視。JNK 通路抑制劑 D-JNK-1（AM-111）是一種治療急性耳蝸損傷的藥物。D-JNK-1 經 TAT 修飾，可通過局部給藥途徑快速內化。AM-111 的 III 期臨床試驗已于 2017 年完成，AM-111 對急性耳蝸損傷后特發(fā)性突發(fā)性神經性聽力損失具有有效的耳部保護作用。
眼球由兩部分組成，前段包括角膜、結膜、房水、房水、晶狀體和虹膜，后段包括玻璃體、后鞏膜、脈絡膜、視網膜。它們共同形成一道生物屏障，通過多種靜態(tài)、動態(tài)和代謝屏障保護眼部，同時阻止眼部治療藥物的輸送。局部用藥適用于前段疾病，局部注射適用于后段疾病。眼部的生理學對眼部藥物有效輸送是一個挑戰(zhàn)，（1）角膜對親水性生物大分子具有很強的抗性，（2）局部注射后藥物進入全身循環(huán)系統(tǒng)。CPP 是眼部藥物輸送的潛在工具，可提高跨屏障的生物利用度。CPPs 的結構對局部給藥后的眼部分布有影響。Liu 等評估了幾種陽離子 CPPs 的眼部滲透性，包括 TAT、聚精氨酸 R8、聚絲氨酸 S8、魚精蛋白和穿透素。穿透素對細胞攝取和體外滲透具有最佳活性。Chu 等通過眼部局部給藥制備了 iRGD 和 TAT 雙修飾脈絡膜新生血管靶向納米粒子。iRGD 和 TAT 分別修飾后，納米粒子的角膜滲透性提高了 5.50 倍和 4.56 倍。雙修飾納米粒子在體外具有最多的細胞攝取，并且在體內也表現(xiàn)出良好的靶向和滲透能力。Tai等開發(fā)了一種納米復合材料，通過局部滴注的方式遞送反義寡核苷酸（ASO）用于眼內腫瘤的基因沉默。通過縮合ASO，以聚酰胺胺（PG5）作為基因載體，并引入穿透素（Pene）以提高攝取效率。納米級的PG5/ASO/Pene通過靜電相互作用穩(wěn)定地結合。納米復合材料經Pene修飾后表現(xiàn)出細胞穿透和基因沉默能力。PG5/ASO/Pene還可顯著抑制皮下和原位裸鼠腫瘤模型中的腫瘤體積增長
CPP 在糖尿病中的應用
目前胰島素給藥的常用方式為患者持續(xù)皮下注射，若能用口服胰島素替代皮下注射，患者的痛苦將大大減輕。但胰島素在小腸內不穩(wěn)定，在腸上皮內通透性差，口服生物利用度低，因此需要開發(fā)一種改進的胰島素給藥系統(tǒng)。利用CPP給藥是一種很有前途的候選方法。在前期研究中，當TAT與胰島素B29賴氨酸殘基共價連接時，可以顯著提高胰島素在Caco-2細胞培養(yǎng)模型中的滲透性，CPP制備的胰島素的生物利用度是普通胰島素的6~8倍。此后，包括聚精氨酸和穿透素在內的CPPs被視為胰島素的潛在載體。Mariko等人的研究表明，胰島素與寡精氨酸（R8）聯(lián)合使用可顯著增加腸道胰島素的吸收，且不會對細胞產生明顯的副作用，另一項研究，Mie Kristensen 等發(fā)現(xiàn)共價結合穿透素與胰島素可增加胰島素的上皮滲透，這是因為穿透素富含Arg和Lys殘基，且具有較高的pI值，在生理pH下帶正電荷，促進與細胞表面帶相反電荷的成分發(fā)生靜電相互作用。并證實CPP序列中精氨酸殘基的存在是增強胰島素上皮滲透的前提條件，聚精氨酸可以增強胰島素在大鼠腸黏膜的傳遞，從而降低血糖水平，而這一作用也依賴于聚精氨酸肽的長度。在最新的研究中，F(xiàn)eng Guo等人將兩親性殼聚糖衍生物（ACS）與CPP共價結合，制備出用于口服胰島素輸送的納米載體。作者聲稱在藥效學研究中，TAT修飾的納米載體對胰島素有明顯的降血糖作用（降低40%）�？梢灶A見，通過CPPs修飾納米粒子表面是一種提高胰島素吸收和輸送的潛在方法。
CPP 作為成像劑和診斷的應用
顯像劑是疾病診斷所必需的物質，能夠追蹤或及時提供藥物治療效果的信息。然而，由于許多非天然化合物無法被細胞膜吸收，因此將顯像劑遞送至患病組織仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。CPPs由于其優(yōu)異的滲透性、高親和力、高穩(wěn)定性，在顯像劑的遞送中起著非常重要的作用。許多研究者也致力于CPPs作為診斷顯像劑的研究，并在臨床前和臨床上取得了一定的進展
CPPs 介導的分子探針作為診斷成像劑
為了準確探測病變部位，許多 CPP 介導的分子探針如可激活 CPP (ACPP) 、AVB-620已被研究用于分子成像。研究表明，ACPP 可以被腫瘤中過表達的基質金屬蛋白酶激活，通過基于熒光共振能量轉移 (FRET) 效應的 FI 和 PA 試劑可以對不同的酶進行成像。在 ACPP 工作的基礎上，Miampamba 等人通過使用 Cy5 和 Cy7 作為熒光團對改變 FRET 的比率熒光讀數(shù)，設計并開發(fā)了一種新型靜脈注射 AVB-620。AVB-620是一種用于乳腺癌診斷的熒光成像劑。實驗結果表明，AVB-620可以在熒光成像攝像系統(tǒng)下對腫瘤進行可視化，在轉移性小鼠乳腺癌模型中對淋巴結狀態(tài)的診斷具有很高的敏感性和特異性，為臨床應用提供了良好的基礎。此外，AVB-620在乳腺癌患者中處于臨床I期研究階段。結果表明，AVB-620在給藥后通過對手術標本進行術中成像獲得腫瘤特異性熒光檢測劑量下是安全的，耐受性良好。此外，Zhu et al.還設計合成了CPPs介導的分子探針作為成像劑。他們首先合成了三種熱活化延遲熒光（TADF）化合物（4CzIPN、NAI-DPAC、BTZ-DMAC），將TADF負載到兩親性CPPs（F6G6（rR）3R2）中，利用CPPs在水中自組裝成納米粒子，構建了TADF納米粒子作為成像劑，具有細胞毒性低、膜穿透性強等優(yōu)點，時間分辨熒光成像結果顯示隨著孵育時間的增加，更多的TADF納米粒子在細胞內聚集，并且在細胞質中觀察到更亮的熒光信號，說明了TADF納米粒子作為成像劑的可行性。然而，TADF納米粒子仍處于基礎研究階段，預計在體外或體內進行更多的研究。
CPPs 介導的納米平臺作為診斷成像劑
放射性標記的 CPP 作為診斷成像劑
放射性標記肽作為傳統(tǒng)的顯像劑，由于其高精度而得到最廣泛的應用。放射性標記的CPPs作為肽介導的顯像劑之一，也被開發(fā)用于疾病診斷。最近，一些放射性標記的CPPs如[ 18 F]-FPPRGD2、[ 18 F]Galacto-RGD和18F-RGD-K5已投入臨床試驗。[ 18 F]Galacto-RGD是第一個應用于人體的RGD PET示蹤劑，在癌癥患者中實現(xiàn)了高特異性和快速代謝。而[18F]-FPPRGD2是第一個被FDA批準用于人體的二聚RGD肽，表明其在膠質瘤中的治療效果良好。此外，還將18F-RGD-K5應用于人體，并通過全身PET/CT測定其放射劑量。結果表明，18F-RGD-K5在膀胱壁的放射劑量最高，可通過頻繁排尿來降低。此外，18F-RGD-K5可被腎臟系統(tǒng)快速清除。
CPP 介導應用的局限性
在過去的 30 年中，CPP 越來越多地用于各種疾病的診斷和治療，是轉染不同細胞類型的最有用的方法之一。CPP 是實現(xiàn)難以靶向的細胞和組織中治療濃度的關鍵因素，從而改善其治療效果。它們的成功不僅取決于其強大的跨膜遞送特性，還取決于其多功能性。它們可以簡單地合成、修改和改進。
然而，CPPs是一把雙刃劍，它們可能由于各種原因引起嚴重的副作用。到目前為止，還沒有一種CPP結合藥物獲得FDA批準，一些臨床試驗也已終止。原因如下:(1)體內組織穩(wěn)定性。快速從血液中清除是一個缺點，因為治療有效載荷可能在到達治療部位之前在血液循環(huán)中因酶降解而降解。(2)免疫原性問題。由于CPPs的多肽特性，它會增加患者發(fā)生不良免疫反應的風險，這不僅會降低藥物效果，還會引起不必要的免疫應激反應。（3）細胞毒性。由于正常組織對治療劑的脫靶細胞吸收，CPPs可以被幾乎所有類型的細胞內化。大多數(shù)研究報道CPPs的毒性較低，但應該注意到，任何物質在高濃度下都可能具有細胞毒性，在正式應用于患者之前，還有許多問題需要解答。CPPs的細胞毒性令人十分擔憂。例如，MAP是一種典型的CPP，其結構與抗菌裂解肽相似，通過擾亂微生物細胞的質膜來影響微生物細胞。據(jù)報道，通過進行各種細胞毒性試驗，MAP在濃度高于1μM時對各種細胞類型均表現(xiàn)出相當高的毒性作。由于MAP在人工膠束存在下的兩親作用，MAP可誘導質子、蛋白質、金屬離子等的泄漏，從而因質膜受損而導致細胞死亡。（4）特異性低。陽離子CPP可以與糖胺聚糖結合是公認的事實，但CPPs是否能與特異性膜受體相互作用仍是一個未知領域。CPP結合藥物的廣泛組織分布可能會因局部濃度較低而降低藥物效率。因此，最大限度地靶向特定細胞而忽略正常細胞是至關重要的。(5)進入胞質溶膠后在內體降解。CPPs和CPP/貨物復合物在溶酶體降解之前從內體運送到胞質溶膠是另一個關鍵問題，人們認為，藥物若停留在核內體中則無法發(fā)揮其生物學功能，因此需要對CPPs進行改造，使其能夠有效地從核內體逃逸，從而加速載體從核內體釋放到胞質溶膠中。同時，CPPs最重要的遞送方式不僅是轉運至靶組織或器官，而且要靶向進入細胞內的特定細胞器，如細胞核和線粒體，以實現(xiàn)有效的治療。
綜上所述，為了實現(xiàn)CPP的臨床應用，克服CPP所面臨的治療難題，迫切需要優(yōu)化低毒、高效、特異性的CPP。
基于 CPP 的優(yōu)化
如上所述，CPPs的臨床應用依賴于一些重要特性的改善，包括增強穩(wěn)定性，延緩CPPs在循環(huán)中被酶降解，降低細胞毒性，提高內體逃逸效率和靶向性。
內體逃逸效率
到目前為止，已經提出了內體逃逸的潛在機制。一種可能的解釋是基于帶正電荷的 CPP，人們認為它們會與內體膜中帶負電荷的成分結合。這將導致膜孔的形成，從而導致 CPP 泄漏。逃逸的另一個可能原因是帶負電荷的磷脂和帶正電荷的 CPP 之間形成離子對，從而跨越內體膜。
為了增加CPPs從內體中的釋放，人們采用了一些最常見的策略，例如，使用融合脂質來改善CPPs在內體的釋放。二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）可以顯著增加藥物從內體的釋放和活性。El-Sayed等人指出，DOPE與脂質體復合物或TAT-pDNA復合物結合后，轉染效果顯著提高。在pH值較低的內體中，DOPE從層狀相轉變?yōu)榈沽呅蜗�。這種轉變相促進了CPP/貨物復合物與內體磷脂的融合，導致膜不穩(wěn)定，從而將CPP/貨物復合物釋放到細胞內空間，質子海綿效應也用于促進CPPs在胞內體的釋放。當溶酶體的pH降低時，藥物的緩沖能力可以捕獲大量質子并引起Cl-內流，導致溶酶體滲透性腫脹，最終導致溶酶體破裂，將內化的CPP/貨物復合物釋放到胞漿中。另一種常用的藥物是組氨酸，組氨酸中的咪唑基團可以質子化引起溶酶體滲透性腫脹和胞內體破裂，已被廣泛用于增強TAT/pDNA復合物的基因表達。另一種有效的方法是使用膜破壞肽來促進CPPs在胞內體的釋放( Wadia等，2004 )病毒能夠輕易突破內體陷阱，因此將病毒融合序列與CPP/貨物復合物結合，利用病毒的機制實現(xiàn)內體逃逸。源自流感病毒血凝素蛋白的HA2肽是一種pH敏感的融合肽。HA2肽的N端為α螺旋結構，可插入脂質體中。在內體內低pH環(huán)境下，構象變化使α螺旋結構暴露并與內體脂質融合，導致胞質中蛋白質和轉運蛋白-肽核酸（PNA）復合物的復合物釋放到內體
細胞器特異性遞送：線粒體遞送
線粒體被公認為細胞的“動力工廠”，控制著大多數(shù)甚至全部的程序性細胞死亡機制。在代謝性疾病的病因學中，線粒體功能障礙被認為是導致患者出現(xiàn)一些異常的罪魁禍首，例如高血壓、癌癥和一些神經退行性疾病，嚴重損害人類健康。然而，很少有治療藥物能夠進入線粒體. Cerrato等設計合成了一系列靶向線粒體的新型小分子CPPs，用于調控線粒體內過程，增強其生物學效應。線粒體穿透肽（mtCPP-1）能將5（6）-羧基熒光素（5-FAM）轉運至質膜，并選擇性地富集到線粒體中，對線粒體膜電位沒有影響，且與SS-31相比，活性氧釋放抑制率降低2倍。實驗數(shù)據(jù)分析表明，與SS-31相比，線粒體的攝取量增加了35%，且在較高濃度下也沒有檢測到毒性。這些結果表明mtCPP-1是一種線粒體CPP。Kang等（2018）開發(fā)了一種可穿透細胞的人工線粒體靶向肽（CAMP），該肽可與抗氧化蛋白人類金屬硫蛋白 1A（hMT1A）結合，形成成功定位到線粒體的 CAMP-hMT1A。CAMP-hMT1A 治療細胞帕金森病模型后可恢復線粒體活性、酪氨酸羥化酶產生并抑制 ROS 釋放。此外，將 CAMP-hMT1A 注射到 PD 小鼠模型的腦內可保護多巴胺能神經元變性和運動障礙。
“智能”細胞內藥物輸送系統(tǒng)
Shin 等(2014)利用基因工程方法成功制備了重組嵌合TAT–gelonin融合毒素(TAT-Gel)。TAT-Gel通過靜電作用與陰離子肝素結合，當系統(tǒng)注射硫酸魚精蛋白時，30 min內75%的TAT-Gel瞬間釋放，隨后CPPs跨過質膜進入腫瘤細胞內，表現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用。此外，基于ATTEMPTS體系，TAT-Gel通過靜電力與肝素偶聯(lián)的抗CEA mAb(T84.66)結合，可以特異地靶向作用于大腸癌細胞上高表達的CEA。與小鼠單獨給予TAT-gelonin相比，TAT-gelonin/T84.66-Hep的靶向遞送率顯著提高，約58倍。
提高細胞特異性系統(tǒng)：可激活的 CPP
CPP內化的機制是與細胞膜上的雙層磷脂非特異性結合，這嚴重限制了CPP的臨床應用。一種可能的增強特異性的方法是利用ACPP來實現(xiàn)CPP的細胞穿透作用，同時利用刺激敏感的可裂解連接子，如pH敏感、酶敏感、溫度敏感、電、磁敏感或光敏感的可裂解連接子。一旦進入特定的組織環(huán)境，ACPP受到外界刺激，連接子就會被裂解，CPP恢復正�；钚浴�
酶在生物體內具有多種功能。在病理組織中，例如炎癥或癌癥部位，蛋白酶、糖苷酶或酯酶等特異性酶的表達水平，通常高于其在正常組織中的濃度。因此，許多腫瘤相關酶因其組織特異性濃度梯度而被廣泛用于酶敏感疾病的診斷和治療。CPP/貨物復合物遞送與酶觸發(fā)系統(tǒng)的結合不僅克服了傳統(tǒng)遞送系統(tǒng)的細胞通透性障礙，而且克服了基于CPP的遞送系統(tǒng)的選擇性障礙。
Jiao 等人還利用 MMP-2 反應肽作為酶促可降解連接體，建立了一種名為 ch-Kn(ss)R8-An 膠束的基因遞送系統(tǒng)，用于 BBB 和膠質瘤雙靶向治療。該連接體結合了血管肽素-2，它可以特異性地結合膠質瘤細胞上過表達的低密度脂蛋白受體相關蛋白-1 (LRP1)。當 MMP2 可裂解連接體被過表達的細胞外 MMP2 降解后，膠束可以有效地靶向膠質瘤細胞，然后進一步遷移到腫瘤中心，導致 R8 暴露。該遞送系統(tǒng)表現(xiàn)出較高的基因轉染效率，并提高了膠質瘤細胞的攝取率。將 ch-K5(ss)R8-An/Dbait 與放射療法聯(lián)合應用可顯著抑制體外腫瘤的生長。
在腫瘤遞送中，pH是觸發(fā)CPPs活化的最常見條件，pH響應性陰離子材料通常聯(lián)合使用。Yu等合成了兩種多肽結合膽固醇聚氧乙烯山梨醇油酸酯，(HE)5-CPSO和(RG)5-CPSO。它們被用來形成混合膠束，以高耐受性將PTX遞送到大腦中。多聚陰離子(HE)5屏蔽了(RG)5的正電荷，以減少生理條件下的非靶向攝取。然而，當(HE)5位于細胞外腫瘤或pH值較低的內體時，其表面電位發(fā)生逆轉，電荷轉變可以激活(RG)5，促進PTX的定向膠束攝取和藥物釋放�；旌夏z束優(yōu)先在腫瘤組織中聚集，與膠質瘤小鼠模型中的對照組相比，顯著抑制了74.84%的腫瘤生長。Tang et al. 也制備了PEG-PLA納米粒用于遞送PTX，并通過(HE)10G5R6肽修飾該納米粒以獲得pH敏感特性，其策略與上述類似，通過在不同pH條件下發(fā)夾結構轉變來控制R6篩選的ON/OFF。
如上所述，這些ACPP具有創(chuàng)新性和令人興奮的特性，但人們普遍認為其激活過程是不可逆的，而且仍然經常發(fā)生在非靶位點而不是靶位點。為了克服ACPP在體內靶向遞送應用中缺乏可逆性的問題，合成了一類新的ACPP，稱為可逆激活CPP（RACPP）。RACPP對生物刺激具有很高的響應性，它們在離開特定的激活位點后會恢復到原來的形式，以避免ACPP/貨物復合物在激活后的非特異性攝取。Tang等人設計了一種新型的pH敏感RACPP（HE-CPP），它使用一個高度pH敏感的掩蔽序列通過聚甘氨酸連接體（HE-CPP）可掩蓋其正電荷，防止ACPPs/貨物復合物的脫靶吸收。聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）與HE-CPP序列偶聯(lián)，組成聚合物膠束（PMs-HE-CPP），可增強特異性并促進包封的紫杉醇（PTX）靶向性。PTX/PMs-HE-CPP表現(xiàn)出根據(jù)周圍pH值可逆的電荷轉換，以及令人滿意的負載容量、包封效率和尺寸分布
結論和未來展望
CPP 是跨質膜轉運藥物或 CPP/貨物復合物的熱門研究對象。自 1988 年發(fā)現(xiàn) TAT 肽以來，已開發(fā)了大量的 CPP。CPP 已廣泛用于遞送不同類型的治療劑、成像劑和 CPP/貨物復合物（包括脂質體和納米顆粒），用于診斷和治療多種疾病。盡管 CPP 正在如火如荼地發(fā)展，但許多基于 CPP 的臨床試驗已大大擴展。事實上，到目前為止，還沒有 CPP 或 CPP/貨物復合物獲得 FDA 批準。在將 CPP 轉化為臨床之前，應該解決許多問題，如下：體內穩(wěn)定性、免疫原性、細胞毒性、缺乏特異性細胞內攝取和無法從內體逃逸。當然，在臨床應用方面，還應考慮成本、合成的難易程度、適合工業(yè)生產和消除。未來CPPs的應用應致力于解決這些問題，并應評估大量新的基于CPP的遞送系統(tǒng)。我們可以使用融合脂質、“質子海綿”效應或膜破壞肽等策略來遞送CPPs，以促進有效的內體逃逸。一系列小的新型CPPs已被設計和合成，不僅可以遞送到目標組織或器官，還可以遞送到特定的細胞內細胞器內，以實現(xiàn)更有效的治療�；� CPP 的遞送系統(tǒng)的主要障礙是有限的細胞類型特異性，因為大多數(shù) CPP 被所有細胞類型吸收，并且由于存在蛋白酶，血漿半衰期較短。已經評估了新策略來提高 CPP 對靶位的特異性，例如以共價或非共價形式將 CPP 與特定配體連接。靶向配體包括抗體、葉酸、轉鐵蛋白和 RGD 肽，這些靶向配體的受體通常在某些腫瘤類型而非正常組織中過表達。此外，“ATTEMPTS”策略不僅可以提高CPP基遞送系統(tǒng)的特異性，還可以保護CPP免受酶降解。ACPP是另一種有前途的提高特異性的系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，CPP被刺激敏感的可裂解連接子所掩蓋，該連接子在特定的組織環(huán)境中被裂解，然后CPP恢復其正常活性，有效地將CPP基遞送系統(tǒng)遞送到細胞內，避免遞送到非靶向部位。
設計一種安全、高效、特異且易于生產、成本低廉的基于 CPP 的遞送系統(tǒng)在臨床應用方面具有巨大的潛力和重要的前景。CPP 和 CPP/貨物復合物有可能為人類疾病的診斷和治療提供更有效的方法，例如癌癥、炎癥、中樞神經系統(tǒng)疾病、耳部保護、眼部和糖尿病。此外，我們堅信 CPP 藥物或 CPP/貨物復合物將在未來幾年內進入市場。
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