摘要：惡性腫瘤已經(jīng)威脅到人類的健康。隨著對腫瘤免疫循環(huán)機(jī)制的深入了解,腫瘤免疫診斷和治療已成為研究的熱點(diǎn)。多肽具有良好的親和力、高特異性、良好的生物相容性、易修飾等特點(diǎn)。肽試劑在腫瘤免疫診斷和治療中具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的應(yīng)用潛力。綜述了針對肽探針的篩選和構(gòu)建的一些新方法和新策略。此外,我們還重點(diǎn)研究了靶向蛋白基腫瘤免疫成像和蛋白基免疫檢查點(diǎn)治療的一些研究進(jìn)展。
分子識(shí)別是分子間通過非共價(jià)鍵形成的特異而專一的相互作用. 在生物體系內(nèi), 分子識(shí)別網(wǎng)絡(luò)精確控制著高度復(fù)雜的生命過程. 發(fā)現(xiàn)新的分子識(shí)別體系, 針對特定靶點(diǎn)建立高親和力及高特異性分子檢測新方法, 是精準(zhǔn)醫(yī)療下對于新型靶向診療技術(shù)的迫切需求. 與抗原-抗體識(shí)別相比, 低分子量的識(shí)別元件具有如靶向多肽、核酸適配體等獨(dú)特優(yōu)勢. 其中, 靶向多肽是指針對特定的生物靶標(biāo)具有特異性親和作用的肽分子. 多肽由幾個(gè)到幾十個(gè)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能各異的氨基酸按照一定的順序通過酰胺鍵連接. 多肽雖然體積小、結(jié)構(gòu)簡單, 但是通常具有與天然蛋白/抗體類似的生物學(xué)功能. 相比抗體識(shí)別, 靶向多肽穿透性強(qiáng)、免疫原性低、易于化學(xué)合成與修飾、批次重復(fù)性高; 相比其他類型的低分子量單元, 如核酸識(shí)別等, 由于氨基酸種類更多且親疏水性、電荷各不相同, 多肽具有更高度的多樣性和更巨大的信息量[1,2]. 因此, 通過有效的篩選、合理的設(shè)計(jì)和多模式的合成策略可以產(chǎn)生多種功能性的靶向多肽. 此外, 多肽還具有一種與生俱來的能力, 即可在特定的條件下實(shí)現(xiàn)可控自組裝. 多肽可在氫鍵、π-π堆積、疏水作用、靜電力等驅(qū)動(dòng)下, 自發(fā)組裝形成有序的超分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 如納米管、纖維、囊泡、片層等, 展現(xiàn)出單分子或分子低聚體所沒有的特性[3]. 自發(fā)的聚集和組裝使得局部配體“密度”增高, 可與靶標(biāo)實(shí)現(xiàn)多價(jià)結(jié)合. 由于多肽緊密組裝, 能避免被酶降解, 具有生物穩(wěn)定性. 尤其是多肽具有生物活性和生物相容性, 能夠賦予超分子探針獨(dú)特的生物學(xué)功能[4]. 綜上所述, 不論是針對小分子多肽探針識(shí)別還是納米化的自組裝多肽靶向診療, 都已經(jīng)成為分子識(shí)別領(lǐng)域的研究前沿, 取得了眾多的研究成果. 目前已有很多綜述對此領(lǐng)域進(jìn)行了報(bào)道[5~7]. 本文簡述了關(guān)于多肽分子探針篩選構(gòu)筑的新方法和新策略, 并選取此前鮮有報(bào)道的多肽分子探針在腫瘤免疫診療領(lǐng)域的應(yīng)用角度進(jìn)行了詳細(xì)綜述. 希望通過本文傳遞近來研究靶向多肽探針篩選構(gòu)筑領(lǐng)域一些思路新穎并具有借鑒意義和應(yīng)用前景的研究成果.
2 小分子靶向多肽探針篩選的新方法
從數(shù)千萬計(jì)的多肽配體文庫中高效地篩選出針對靶標(biāo)具有親和力和特異性的多肽既是關(guān)鍵, 也是難點(diǎn). 傳統(tǒng)的組合化學(xué)篩選方法周期長、效率低、分析鑒定耗時(shí), 傳統(tǒng)的噬菌體展示方法難以進(jìn)行非天然氨基酸插入或修飾, 具有局限性. 因此, 發(fā)展新的篩選方法是高效獲得靶向親和配體的關(guān)鍵途徑. 顯然, 實(shí)現(xiàn)高效篩選的手段其一是采用合理的設(shè)計(jì)使肽庫簡并, 其二是發(fā)展新型高通量的方法可以快速完成篩選.
趙課組[8] 利用反義肽簡并性和正義肽-反義肽靶向識(shí)別原理構(gòu)建了靶向小分子多肽文庫. 反義肽現(xiàn)象是根據(jù)遺傳密碼的簡并性由核酸向蛋白衍生出來的一種自然現(xiàn)象, 相當(dāng)于把大量隨機(jī)的氨基酸排列組合用核酸堿基編碼. 例如, 可將一個(gè)庫容量為20 10 的十肽全庫通過理性設(shè)計(jì)降低8個(gè)數(shù)量級(jí). 利用反義肽作用的專一性, 篩選到新型的靶向多肽與關(guān)鍵膜蛋白的相互作用, 有效地干擾病毒對細(xì)胞的穿透. 作為親和配基用于蛋白質(zhì)的分析檢測中, 可實(shí)現(xiàn)疾病相關(guān)診療探針的研發(fā). 尤其是該課題組發(fā)展的新型溶酶體四次穿膜蛋白的靶向多肽在細(xì)胞定位、靶向殺傷、腫瘤診療方面具有廣泛應(yīng)用[9,10].
上述提及的兩種手段各自用巧妙的方法實(shí)現(xiàn)了肽庫的簡并, 使得目標(biāo)分子最大可能地留在小范圍的肽庫中. 然而, 很多情況下肽庫簡并并不能遵循一定的規(guī)律, 大規(guī)模的篩選不可避免, 開發(fā)一類高效而通用的高通量篩選技術(shù)非常有必要. 這就需要借助一些自動(dòng)化的高效的篩選工具. 首先, 新型質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為高效的多肽篩選提供了強(qiáng)有力的工具. Yang課題組[12]基于新型的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展了高通量糖基化肽段的篩選方法, 該方法基于階梯能量的一步質(zhì)譜采集法, 提高了糖肽鑒定的通量并開發(fā)了pGlyco 2.0糖肽檢索引擎, 從糖鏈、肽段、糖肽三個(gè)層面對糖肽數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行精確質(zhì)控, 從而大幅提升了N糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析的通量和精準(zhǔn)度. 最后, 這一研究報(bào)道了目前最大的糖基化數(shù)據(jù)集: 在1%的假陽性率下, 研究人員在小鼠的5個(gè)臟器中鑒定到了超過一萬條N糖肽.
此外, 微流控芯片系統(tǒng)因分析效率高、可靈活設(shè)計(jì)、自動(dòng)控制并通量集成等特點(diǎn)在高通量篩選方面顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢, 利用微流控芯片技術(shù)進(jìn)行配體文庫篩選是研究熱點(diǎn)之一. 例如, Xu課題組[13] 報(bào)道了一種高通量微芯片, 將不同的蛋白點(diǎn)在芯片上形成微陣列, 配體庫與芯片進(jìn)行相互作用, 與陽性蛋白或陰性蛋白結(jié)合均會(huì)在響應(yīng)的點(diǎn)陣發(fā)出信號(hào), 整個(gè)富集過程通過掃描微陣列就可以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測. 本課題組在微流控芯片高通量多肽篩選新方法上也進(jìn)行了多年的研發(fā). 基于光刻微腔陣列芯片, 實(shí)現(xiàn)10 8 庫容量的組合化學(xué)肽庫分選和基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)原位測序. 全流程可在幾小時(shí)內(nèi)完成, 相較于常規(guī)方法數(shù)天的篩選周期, 效率顯著提高(圖1(b))[14]. 基于高效率篩選, 進(jìn)一步發(fā)展高內(nèi)涵篩選, 同時(shí)獲得更多參數(shù). 將微腔陣列中的多肽以原位“打印”的形式轉(zhuǎn)移至表面等離子體共振成像(SPRi)芯片, 實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、在線、免標(biāo)記檢測, 創(chuàng)新地實(shí)現(xiàn)了兩組陣列同時(shí)定性(原位測序)和定量(原位親和力表征)分析, 檢測靈敏度達(dá)到納克級(jí)(圖1(c))[15]. 利用上述的高效平臺(tái), 篩選得到新型多肽靶向多肽CP, 其針對腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的K D 達(dá)到7.37×10 −9 M, 與多克隆抗體相當(dāng). CP血液循環(huán)半衰期近3 h,與常見多肽的活體半衰期只有數(shù)分鐘相比, 穩(wěn)定性顯著提高. 將CP與新型近紅外二區(qū)(NIR-II)信號(hào)單元IRT偶聯(lián)后(CP-IRT)進(jìn)行活體造影, 腫瘤/健康組織信號(hào)比值接近9, 顯著優(yōu)于此前報(bào)道的小分子光學(xué)探針. 進(jìn)而, 其還可快速排泄,6小時(shí)內(nèi)約90%的CP-IRT可經(jīng)泌尿系統(tǒng)排出. 相比之下, 雖然同樣具有靶向功能, 抗體修飾的IRT在肝臟大量富集, 顯示了小分子探針的優(yōu)勢[16].
3 . 超分子多肽納米探針篩選構(gòu)筑的新進(jìn)展
通過設(shè)計(jì)制備結(jié)構(gòu)有序、構(gòu)象可控、多價(jià)識(shí)別、性質(zhì)穩(wěn)定的超分子探針實(shí)現(xiàn)納米尺度檢測有望解決上述問題. 尤其是多肽具有生物活性和生物相容性, 能夠賦予超分子探針獨(dú)特的生物學(xué)功能. 近年來, 基于多肽超分子的生物醫(yī)學(xué)檢測已成為納米分子診療研究的熱點(diǎn), 涌現(xiàn)了許多成果. 例如, 多肽在形成組裝體過程中, 可改變腫瘤細(xì)胞黏度, 擾亂胞內(nèi)生理平衡, 從而殺滅腫瘤細(xì)胞[17]. 又如, 在活體中, 一些多肽配體在受體處特異自組裝形成納米結(jié)構(gòu), 可作為藥物或信號(hào)分子載體, 實(shí)現(xiàn)靶向輸運(yùn)[18]. 這些前瞻性工作彰顯了超分子在性質(zhì)和功能方面的優(yōu)勢.
多肽類超分子材料還有一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)是組織相容性, 其中, 基于肽的水凝膠由于具有易于合成修飾、 可生物降解和有一定的力學(xué)性能等特點(diǎn)在組織工程、藥物緩釋等方面表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力. 然而, 多肽水凝膠分子結(jié)構(gòu)具有多樣性, 此前對于多肽分子水凝膠材料既沒有形成一定的構(gòu)筑和預(yù)測規(guī)律, 也沒有成熟可行的大規(guī)模篩選方法, 極大地限制了多肽水凝膠領(lǐng)域的研究進(jìn)度. 隨著人工智能技術(shù)的發(fā)展, 機(jī)器學(xué)習(xí)成為信息化時(shí)代發(fā)展科技的重要工具, 為眾多領(lǐng)域的研究工作提供了新方法. Li課題組[22]建立了一個(gè)多肽水凝膠文庫, 通過分析其化學(xué)特征并進(jìn)行機(jī)器學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)了一個(gè)多肽水凝膠自組裝行為的篩選程序, 可以實(shí)現(xiàn)高通量篩選數(shù)據(jù)傳輸. 這種方法將物理結(jié)構(gòu)、化學(xué)特性及其自組裝行為聯(lián)系在一起, 加快了生物醫(yī)學(xué)用途的新型多肽分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì). 該研究通過高通量組合化學(xué)策略建立了容量為2304的多肽文庫, 通過氨基酸單元的設(shè)計(jì), 使得可形成水凝膠的多肽分子涵蓋其中. 利用深度學(xué)習(xí)的方法, 使得機(jī)器習(xí)得并總結(jié)出自然界中多肽形成水凝膠的內(nèi)在規(guī)律與機(jī)制, 實(shí)現(xiàn)對肽庫中的每個(gè)多肽分子的計(jì)算、模擬與分析, 可以得到二維結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)、親疏水、共軛等在內(nèi)的3000余個(gè)生物、物理及化學(xué)參數(shù)并計(jì)算這些參數(shù)所代表的數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的關(guān)系, 預(yù)測未知水凝膠的形成, 并指導(dǎo)設(shè)計(jì)(圖2(b)). 隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來, 利用人工智能方法輔助實(shí)現(xiàn)生物材料及超分子藥物等的發(fā)現(xiàn)將成為趨勢.
4 多肽在腫瘤免疫診斷中的應(yīng)用進(jìn)展
分子探針需要在血液中循環(huán)最終滯留于病灶部位, 環(huán)化是增加多肽穩(wěn)定性的有效手段. Bristol-Myers-Squibb (BMS)公司篩選出了兩類大環(huán)肽可靶向PD-L1, 展現(xiàn)出了良好的結(jié)合能力與生物穩(wěn)定性, 這兩種大環(huán)肽與PD-L1結(jié)合形成的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)也為PD-1/PD-L1途徑的小分子阻斷劑的設(shè)計(jì)提供了依據(jù)[29,30]. 其中WL12肽具有單個(gè)伯胺, 適合修飾, 常被放射標(biāo)記后用于成像診斷. Nimmagadda課題組[26,27] 基于此分別設(shè)計(jì)了 64 Cu和 68 Ga修飾的WL12分子探針用于正電子掃描成像(PET)造影劑, 均可以在注射后60分鐘之內(nèi)快速而無創(chuàng)的成像. 除此之外, Li課題組[31]利用噬菌體展示技術(shù)篩選的多肽TPP-1也可通過與PD-L1特異性結(jié)合來激活T細(xì)胞. Zhang課題組[28] 用 18 F或 64 Cu對其進(jìn)行標(biāo)記并將其中一部分TPP-1聚乙二醇化形成四聚體, 并對制備的探針進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn) 64 Cu標(biāo)記的探針顯示出較好的成像潛能, 且聚乙二醇化后的探針在血液中的停留時(shí)間更長. 雖然這些研究不斷提升著分子探針的性能, 但目前還多處于基礎(chǔ)研究階段.
5 多肽在腫瘤免疫檢查點(diǎn)阻斷中的應(yīng)用進(jìn)展
免疫檢查點(diǎn)表達(dá)于免疫及相關(guān)細(xì)胞, 與腫瘤細(xì)胞上的受體結(jié)合后通過抑制免疫細(xì)胞的活性和增殖能力來抑制免疫應(yīng)答, 從而誘導(dǎo)免疫逃逸[32,33]. 目前, 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一系列可以作為腫瘤診療靶標(biāo)的免疫檢查點(diǎn), 其中研究最深入的是在上一節(jié)中提及的程序性死亡受體1 (programmed death 1, PD-1)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4). 篩選及制備出的一些分子可以與免疫檢查點(diǎn)或其配體特異性結(jié)合, 通過阻斷其相互作用而使免疫細(xì)胞發(fā)揮正常功能, 這類化合物被稱為免疫檢查點(diǎn)阻斷劑(immunocheckpoint blockade). 目前美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)的免疫檢查點(diǎn)阻斷劑主要為抗體類藥物. 上一節(jié)論述了抗體診療試劑的不足, 同樣, 用免疫原性較低、穩(wěn)定性高、合成簡單的多肽替代單克隆抗體作為免疫檢查點(diǎn)阻斷藥物也成為可能.
一般來說, 在多肽文庫中篩選出的特異性多肽親和力達(dá)不到轉(zhuǎn)化臨床應(yīng)用的強(qiáng)度, 這也是多肽類診療試劑一直以來面臨的挑戰(zhàn). 將PD-L1的內(nèi)源性配體PD-1胞外域部分分離并進(jìn)行改造后得到的分子, 其與PD-L1的結(jié)合能力可得到提高. Ring課題組[45]利用蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)將PD-1胞外域改造為具有高親和力的PD-L1結(jié)合蛋白,K D 可達(dá)到110 pM級(jí)別. 另外, 將該蛋白用 64 Cu標(biāo)記, 可用作PET成像示蹤劑, 由于其極強(qiáng)的親和力極有希望用于臨床. 最近, Hong課題組[43]報(bào)道了一種β-發(fā)夾狀的多肽樹狀大分子系統(tǒng), 其是將PD-1胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域分離改造得到的多肽片段與樹狀大分子多價(jià)綴和, 形成的多肽-樹狀大分子復(fù)合物由于拓?fù)渥饔枚郫B形成了β-發(fā)夾狀, 不僅由于多價(jià)綴和而增強(qiáng)了靶向親和力, 還具有較高的穩(wěn)定性, 可用于活體內(nèi)的靶向成像與示蹤, 并且可發(fā)展成為納米型PD-1阻斷劑.
事實(shí)上, PD-L1不僅存在于細(xì)胞膜表面, 在細(xì)胞質(zhì)中也有大量儲(chǔ)存, PD-L1可通過囊泡動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面, 與癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān). 研究人員發(fā)現(xiàn), 在細(xì)胞質(zhì)中存在的PD-L1會(huì)在酶的催化下被棕櫚酰化修飾, 從而抑制溶酶體對PD-L1的降解, 增強(qiáng)PD-L1的表達(dá)和功能. Xu課題組[46]基于此開發(fā)出了棕櫚�；偁幮远嚯腃PP-S1, 由細(xì)胞穿透肽和PD-L1胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中棕櫚�；揎椬饔玫男蛄薪M成, CPP-S1通過競爭作用減少了PD-L1的棕櫚�；揎�, 降低了腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá), 從而增強(qiáng)了T細(xì)胞的免疫力. 對PD-L1來說, 該多肽既是阻斷劑, 又是抑制劑, 這為基于免疫檢查點(diǎn)篩選構(gòu)筑新型靶向藥物的策略提供了新思路(圖4(b)).
對于多肽類診療試劑來說, 由于人體結(jié)構(gòu)復(fù)雜精妙以及腫瘤微環(huán)境的錯(cuò)綜復(fù)雜, 如何開發(fā)具有良好的親和力和穩(wěn)定性的多肽是需要解決的難點(diǎn)問題, 環(huán)化、定向進(jìn)化或多價(jià)綴和為這些問題提供了一些解決策略. 另外隨著對免疫檢查點(diǎn)探索的不斷深入, 研究者們可以開發(fā)出不同功能、種類的多肽類診療試劑, 更全面、有效地應(yīng)對腫瘤免疫診療中出現(xiàn)的各種問題如普適性、耐藥性等. 總而言之, 雖然目前腫瘤的免疫治療效果極佳, 但目前僅對少部分患者起效, 免疫檢查點(diǎn)診療技術(shù)仍然存在巨大的創(chuàng)新研發(fā)空間, 有望從多個(gè)思路和角度實(shí)現(xiàn)突破和革新.
6 總結(jié)與展望
通過理性的設(shè)計(jì)與高效的篩選發(fā)現(xiàn)新的具有親和力、特異性和穩(wěn)定性的多肽分子探針技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用價(jià)值. 通過高效篩選和精準(zhǔn)控釋策略構(gòu)筑的小分子和超分子多肽探針在腫瘤以及非腫瘤等重大疾病診斷和治療方面發(fā)揮著重要作用. 當(dāng)然, 在多肽靶向探針篩選研究以及在免疫診療的應(yīng)用中, 我們還面臨著一系列的困難. 首先, 生命體系極其復(fù)雜, 許多具有良好性能的多肽在溶液中經(jīng)過嚴(yán)格的純度、濃度、酸度控制, 可形成精巧的納米結(jié)構(gòu), 然而這種結(jié)構(gòu)在復(fù)雜的活體中卻很難實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定可控. 加之目前報(bào)道的靶向分子探針大多從分子層面入手設(shè)計(jì), 由于各單元的設(shè)計(jì)和合成都相對獨(dú)立. 在復(fù)雜活體環(huán)境中各功能難以協(xié)同達(dá)到最佳.
此外, 組裝序列通常模仿少數(shù)天然的蛋白序列, 難以在形貌及功能上有所突破. 隨著有機(jī)化學(xué)、合成生物學(xué)的發(fā)展, 以及基于人工智能技術(shù)的深度學(xué)習(xí)等技術(shù)的輔助, 高效地錨定、篩選、合成具有更好協(xié)同性能、更精準(zhǔn)選擇性靶點(diǎn)和更高穩(wěn)定性的多肽探針是該領(lǐng)域創(chuàng)新發(fā)展的必由之路. 尤其是在本文所論述的免疫相關(guān)的靶點(diǎn)識(shí)別與抑制方面, 與傳統(tǒng)的靶點(diǎn)不同, 該類靶點(diǎn)涉及的生理病例過程及相關(guān)信號(hào)通路復(fù)雜, 涉及多器官、多系統(tǒng)聯(lián)動(dòng), 因此, 診療試劑的穩(wěn)定性、長效性和可控性顯得尤為重要.
最后, 在發(fā)展新的功能性多肽探針的同時(shí), 提高多肽探針的生物利用度和降低多肽探針的生物毒性是相輔相成的兩方面研究. 一方面, 為了提高多肽探針的生物利用度, 往往對其進(jìn)行改性修飾, 如引入一些非天然的分子, 如D型氨基酸、高分子等. 同時(shí)這些改性也帶來一些生物相容性等方面的隱患. 兩方面如何權(quán)衡與評(píng)估也依賴于生物化學(xué)、計(jì)算化學(xué)、納米毒理學(xué)等領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展.
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