LC-MS/MS 液質(zhì)方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證
瀏覽量：2267 ｜ 2024/2/29 15:00:46
前言
一個(gè)分析方法用于臨床常規(guī)檢驗(yàn)之前,進(jìn)行條件優(yōu)化和性能驗(yàn)證是必需的。如果實(shí)驗(yàn)室自建的LC-MS/MS方法要應(yīng)用于臨床診斷,需要在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中對(duì)所有的分析步驟如質(zhì)譜條件、色譜條件和樣品處理?xiàng)l件等進(jìn)行優(yōu)化,確保建立的方法可以檢測(cè)目標(biāo)分析物。為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠,證明分析方法的性能符合臨床檢驗(yàn)的目的和要求,必須對(duì)開(kāi)發(fā)的方法進(jìn)行嚴(yán)格而全面的方法驗(yàn)證。
確定目標(biāo)分析物
在計(jì)劃開(kāi)發(fā)一個(gè) LC-MS/MS方法時(shí)，首先要掌握目標(biāo)分析物的特性，包括目標(biāo)分析物的理化性質(zhì)、預(yù)期濃度、生物樣本類(lèi)型(血清、血漿、尿樣、全血)、目標(biāo)分析物的形式(游離型還是結(jié)合型)、是否有代謝物、是否存在同分異構(gòu)體、分析方法的臨床用途(診斷、篩查、預(yù)后)、是否有其他分析方法等信息。
文獻(xiàn)檢索
如果對(duì)于目標(biāo)分析物不太熟悉,則需檢索收集目標(biāo)分析物的檢測(cè)方法,特別是LC-MS/MS方法的文獻(xiàn)報(bào)道，將已有的方法作為方法開(kāi)發(fā)的起始點(diǎn)。對(duì)于已經(jīng)報(bào)道的分析方法,需要關(guān)注的信息有:
①質(zhì)譜條件,所使用的質(zhì)譜類(lèi)型、離子化方式、離子檢測(cè)通道以及質(zhì)譜參數(shù)；
②液相條件，色譜柱類(lèi)型、流動(dòng)相組成、洗脫方式；
③樣品處理?xiàng)l件：樣品類(lèi)型、樣品量、處理方法。對(duì)于一些特殊的信息如穩(wěn)定性、同分異構(gòu)體、干擾都需要重點(diǎn)關(guān)注,在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中詳細(xì)考察。
優(yōu)化質(zhì)譜方法
臨床檢驗(yàn)用途的 LC-MS/MS方法大部分為靶向定量方法，即對(duì)已知分析物進(jìn)行定量檢測(cè)，通常采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)或者選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)進(jìn)行分析。質(zhì)譜方法優(yōu)化的第一步是配制純標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行質(zhì)譜掃描。根據(jù)目標(biāo)分析物的極性大小選擇ESI或者APCI離子化方式,其中ESI比較合適于中等偏大極性化合物,APCI適合極性小到中等的化合物。根據(jù)目標(biāo)分析物的功能基團(tuán)確定離子極性(正負(fù)離子),MS/MS是實(shí)現(xiàn)分析方法特異和靈敏的重要保證，但前提是進(jìn)行合適的離子選擇，即挑選質(zhì)譜響應(yīng)高、選擇性好的碎片離子。最好選擇兩個(gè)以上的離子通道(ion transition),分別作為定量和定性離子通道(quantifier and qualifier)，應(yīng)盡量避免選擇一些非特異的離子通道(如脫水)。離子通道確定后,必須優(yōu)化離子源參數(shù)和離子通道參數(shù)。在日常的LC-MS/MS分析中,應(yīng)密切監(jiān)視定量離子通道和定性離子通道的信號(hào)比值,所有的樣本中的比值應(yīng)當(dāng)保持一致。如果發(fā)現(xiàn)有比值差異特別大的結(jié)果,需仔細(xì)分析差異來(lái)源,排除可能的干擾。對(duì)于某些穩(wěn)定差、離子化效率低、不易碎裂、濃度很低的分析物，采用衍生化方法可能是較好的選擇。
基質(zhì)效應(yīng)是基質(zhì)中某些成分的存在導(dǎo)致質(zhì)譜離子化效率顯著改變，可引起 LC - MS/MS結(jié)果產(chǎn)生偏差，是LC-MS/MS方法開(kāi)發(fā)必須考察的因素�？赏ㄟ^(guò)下列方法判斷基質(zhì)效應(yīng)是否存在：
①采用空白基質(zhì)提取后加入與純?nèi)軇舛认嗤姆治鑫铮容^兩者的信號(hào)差別；
②柱后流動(dòng)注射法，發(fā)現(xiàn)存在基質(zhì)效應(yīng)特別是離子抑制時(shí)，可通過(guò)：1改進(jìn)色譜，使分析物避開(kāi)在離子抑制時(shí)間出峰；②改進(jìn)樣品處理方法，使樣品更加干凈；
③采用同位素內(nèi)標(biāo)，抵消離子抑制對(duì)分析物定量的影響；
④其他方法包括減少進(jìn)樣量，稀釋樣品，降低液相流速，用揮發(fā)性酸替代三氟乙酸、改變離子化方法(從ESI換成APCI)等也可減輕基質(zhì)效應(yīng)。
還有一種與質(zhì)譜檢測(cè)相關(guān)的不利因素為交叉干擾（cross-talk），又叫記憶效應(yīng)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)時(shí),如果兩個(gè)離子通道的碎片離子相同(或類(lèi)似,相差一兩個(gè)分子量單位),前一個(gè)離子通道掃描結(jié)束后,碰撞室里的離子來(lái)不及清除,會(huì)影響下一個(gè)離子通道的定量(如果色譜完全分離則無(wú)此影響)。
消除交叉干擾的辦法:
1選擇特異的碎片離子(特別是用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)時(shí));
2避免同時(shí)檢測(cè)過(guò)多的離子通道,增加離子通道之間掃描時(shí)間間隔(100~300 ms);
3改變離子通道的順序或者設(shè)置額外的無(wú)用的離子通道(dummy MRM)。
優(yōu)化色譜方法
早期LC-MS/MS用于生物分析或者臨床檢驗(yàn)時(shí)，許多人認(rèn)為串聯(lián)質(zhì)譜儀具有絕對(duì)的選擇性,樣本制備和色譜分離顯得無(wú)關(guān)緊要。直到發(fā)現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)、同分異構(gòu)體和源內(nèi)裂解對(duì)分析結(jié)果影響很大,才意識(shí)到色譜分離的重要性。開(kāi)發(fā)良好的LC-MS/MS方法需要考慮流動(dòng)相、色譜柱、洗脫方式等色譜條件的優(yōu)化，而這些色譜條件的選擇優(yōu)化依據(jù)為目標(biāo)分析物的理化特征和分析所需達(dá)到的目的。流動(dòng)相最好選擇符合分析要求的溶劑如LC-MS級(jí)水、HPLC級(jí)溶劑(純度>99.9%),用揮發(fā)性添加劑如甲(乙)酸、甲(乙)酸銨、氨水、三氟乙酸等,盡量不要用不揮發(fā)性堿、鹽(如硫酸鹽、磷酸鹽等),以免影響離子化效率,損傷
質(zhì)譜儀。色譜柱的選擇根據(jù)分析物的酸堿性質(zhì)、極性大小,可選用非極性固定相C18、C8、C4、苯基等,或極性固定相氰基、硅膠、氨基等填料類(lèi)型。另外還要考慮洗脫方式的優(yōu)化,采用等度洗脫還是梯度洗脫,起始的溶劑比例,運(yùn)行時(shí)間,色譜柱溫度,進(jìn)樣體積,樣品溶劑等因素對(duì)分析效率和分析結(jié)果的影響。對(duì)于一個(gè)成功的 LC-MS/MS方法而言，良好的色譜保留和色譜分離必不可少。增加色譜保留，改善分辨率就是優(yōu)化上述幾個(gè)色譜條件的過(guò)程,可通過(guò)增加色譜柱的長(zhǎng)度、改變流動(dòng)相的組成（添加劑比例、pH)、減少起始有機(jī)相比例、減緩梯度、降低流速、提高柱溫等方法實(shí)現(xiàn)。
近年來(lái)，由于 LC-MS/MS在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛，許多檢驗(yàn)項(xiàng)目逐漸轉(zhuǎn)移到LC-MS/MS平臺(tái),樣本量越來(lái)越大,因此對(duì)檢測(cè)通量的要求也越來(lái)越高。采用<2μm填料的固定相,使得色譜分離可以在非常短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn),使色譜峰非常尖銳。但同時(shí)需要配置比較高端的質(zhì)譜儀采集足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)（>10~15 個(gè)采集點(diǎn)），實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。另外還需要注意有效的樣本處理以?xún)艋飿颖?避免樣本中殘留顆粒堵塞管路,降低色譜柱壽命。色譜優(yōu)化還需要注意的一個(gè)問(wèn)題就是對(duì)同分異構(gòu)體的分離，由于質(zhì)譜儀對(duì)于同分異構(gòu)體幾乎沒(méi)有分辨能力，因此確保色譜分離是實(shí)現(xiàn)這些化合物準(zhǔn)確定量的前提。
LC-MS/MS分析檢測(cè)的先進(jìn)性就是采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)可以校正樣品在提取、分離、離子化等過(guò)程中的損失，獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。選擇合適的內(nèi)標(biāo)對(duì)于分析方法的性能有著舉足輕重的影響。如有可能，推薦采用同位素標(biāo)記物(2H，13C，15N)作為內(nèi)標(biāo)，因?yàn)橥凰貎?nèi)標(biāo)幾乎與目標(biāo)分析物性質(zhì)相同，僅在質(zhì)量數(shù)上有差異，可以被質(zhì)譜儀所區(qū)分。同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)校正有很好的效果，因此采用同位素內(nèi)標(biāo)的方法更容易獲得準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可重復(fù)的結(jié)果。對(duì)于氘標(biāo)記(2H)的內(nèi)標(biāo)，標(biāo)記的位置最好在苯環(huán)或者骨架上，同時(shí)要注意潛在的氫/氘交換的不利影響。建議內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量數(shù)比分析物相差3以上。
優(yōu)化前處理方法
臨床樣品常見(jiàn)的有血清、血漿、尿樣、全血等種類(lèi),其特點(diǎn)是:
1、太臟,樣品中含有其他組分干擾分析測(cè)定;
2、太稀,樣品中待測(cè)物濃度太低,無(wú)法檢測(cè)到;
3、生物樣品與LC-MS/MS分析系統(tǒng)不兼容,如不處理可能損害分析系統(tǒng)。
LC-MS/MS方法的失敗常常是由于樣品預(yù)處理不當(dāng),導(dǎo)致樣品信號(hào)的抑制或者共存物的干擾。測(cè)定之前進(jìn)行分離、純化、濃縮是十分重要的。
生物樣品預(yù)處理的目的在于：
1、凈化樣品，去除干擾成分(鹽、蛋白、磷脂);
2、提高靈敏度(濃縮樣品、提高質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào));
3、保護(hù)進(jìn)樣系統(tǒng)和色譜柱;4優(yōu)化色譜分析過(guò)程，提高通量。
常用的樣品處理方法有蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法，另外還有超濾、稀釋、衍生、水解、免疫親和等樣本處理方法,根據(jù)分析目標(biāo)和樣本屬性進(jìn)行合理選擇。
