在液相系統(tǒng)分析過程中,有沒有遇到過色譜峰前延現(xiàn)象?為什么有時候同一個樣品減小進樣量色譜峰就變的很好看?日常的分析工作中,我們通常將更多精力集中在流動相和儀器方法的選擇上,忽視了樣品進樣溶劑的重要性。
如果溶劑選擇不當(dāng)則會產(chǎn)生“溶劑效應(yīng)”,使我們在定性和定量分析中產(chǎn)生誤判,影響分析結(jié)果。因此,了解“溶劑效應(yīng)”產(chǎn)生的原因及掌握避免“溶劑效應(yīng)”的基本方法對我們分析工作者是十分必要的。今天小析姐就跟大家分享一下,液相分析過程中“溶劑效應(yīng)”的那些事兒~
PART 01 溶劑效應(yīng)是怎么回事兒
>>>> 1.溶劑效應(yīng)的概念
通常情況下對于溶劑效應(yīng)理解為稀釋劑溶劑強度大于流動相時造成色譜峰變形的現(xiàn)象。如用純乙腈溶解樣品,注入流動相為乙腈-水(18:82)的反相系統(tǒng)中,會造成峰分叉或拖尾的結(jié)果。但是這種概念不能解釋實踐中其他由稀釋劑導(dǎo)致的色譜行為異,F(xiàn)象,如溶出曲線研究中pH6.8溶出介質(zhì)的溶出樣品主峰峰型異常、或加入SDS助溶后峰分叉等情況,這些情況中稀釋劑的溶劑強度并不一定大于流動相,但是卻發(fā)生了色譜行為異常的現(xiàn)象。
鑒于許多由稀釋劑導(dǎo)致的色譜行為異,F(xiàn)象不能用目前的溶劑效應(yīng)進行解釋,筆者認為有必要將溶劑效應(yīng)的概念進行重新闡述:溶劑效應(yīng),是指由于供試品中特定組分在稀釋劑與流動相中所處狀態(tài)的差異對色譜行為的不利影響。如果這種不利影響較為嚴重,則可能造成明顯的色譜行為異常,如峰分叉、拖尾等。
>>>> 2.溶劑效應(yīng)的產(chǎn)生過程解析
第一階段:樣品剛被注入系統(tǒng),進入色譜柱后,流動相氛圍中的目標物以正常速度被洗脫。因強溶劑洗脫,移動速度快,樣品在空間上開始慢慢分裂。
第二階段:在一定時間內(nèi),溶劑氛圍中的目標物移動始終快一些,前后兩部分距離擴大。但移動快的目標物所處氛圍逐漸被流動相稀釋(注:因為溶劑和流動相均不保留),其移動速度會逐漸降至正常流速。直到前面目標物的氛圍完全被流動相替代,前后兩部分的距離穩(wěn)定下來。因而,樣品溶劑與流動相洗脫強度差距越大,兩部分目標物最終的距離拉的越大。
第三階段:所有目標物在色譜柱中正常移動,但分裂已不可逆轉(zhuǎn)。
經(jīng)過檢測器,同一目標物給出了兩個色譜峰。其中進柱前即擴散進入流動相的那部分目標物組成了后面的色譜峰,它的保留時間與目標物的真實保留時間基本吻合。
簡單概括,強洗脫溶劑不均衡地參與了目標物的洗脫,使色譜峰保留時間整體提前,而樣品在柱前的不充分擴散導(dǎo)致了峰形扭曲。這種影響輕則導(dǎo)致峰展寬,嚴重時甚至導(dǎo)致峰裂分,給定性定量帶來災(zāi)難。
PART 02 溶劑效應(yīng)為啥會發(fā)生!
>>>> 1.溶劑強度
在反相色譜系統(tǒng)中溶劑強度的順序為水(最弱)<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷(最強)。溶解樣品的溶劑強度大于該樣品出峰時流動相強度,樣品溶劑可以看成流動相的一部分,一部分樣品溶解于溶劑中會被迅速洗脫出色譜柱,而一部分樣品溶解于流動相,被流動相洗脫出,這樣會造成色譜峰的展寬或者分叉。
>>>> 2.進樣體積
當(dāng)進樣體積較小時,擴散至流動相中的溶質(zhì)占大多數(shù),且擴散在很短時間內(nèi)完成,因此峰形與用流動相直接溶解樣品無大差異。隨著進樣的體積增大,留在溶劑本身里的溶質(zhì)的量逐漸增大,當(dāng)進樣體積增大到一定數(shù)量,留在溶劑里的溶質(zhì)的量變得不可忽略,在色譜圖上就表現(xiàn)為色譜峰的分叉、拖尾等。
>>>> 3.溶劑與流動相的兼容性
有時,當(dāng)我們使用流動相或流動相中的有機相無法直接溶解樣品,這時很多小伙伴會選擇使用氯仿、甲苯等能溶的溶劑,甚至DMSO這樣的“萬能溶劑”來溶解樣品。這樣進樣的結(jié)果是溶劑與流動相不兼容,溶質(zhì)難以在流動相中擴散。又如,在做參比制劑的溶出曲線中,溶媒中經(jīng)常加入表面活性劑。而帶有表面活性劑的溶劑進樣后,由于溶質(zhì)在含有表面活性劑的溶劑中的分配系數(shù)與在流動相中的分配系數(shù)存在較大差異,就會導(dǎo)致峰形的問題,甚至保留時間的漂移。
>>>> 4.電離狀態(tài)
電離狀態(tài)的差異主要由溶劑和流動相各自的pH差異引起。我們都知道,在反相體系中,目標化合物的存在狀態(tài)不同,保留行為會有明顯的差異,而存在狀態(tài)就取決于目標化合物在不同pH體系內(nèi)的電離狀態(tài)。若樣品在溶劑和流動相中電離狀態(tài)差異較大,樣品溶液在接觸流動相的過程中,來不及緩沖至流動相中的電離狀態(tài),這個時間如果較長,就容易表現(xiàn)為保留時間發(fā)生錯位或峰形變形,如下圖的案例。
>>>> 5.柱前管路
柱前管路內(nèi)徑越大、管路越長,越利于目標物向流動相擴散,而且使用更粗的管路比更長的管路有效(注:假設(shè)死體積相同)。雖然粗的管路加劇了等度條件下的柱外展寬,對柱效有危害,然而相較于峰分叉的危害而言,前者尚能接受。
這就是為什么有時候會發(fā)現(xiàn),HPLC的液相(管路死體積大)比UPLC的液相(管路死體積。┥V峰型好。
PART 03 有什么危害?
1.導(dǎo)致柱效下降,危害分離;
2.危害峰形,危害定量,甚至危害定性;比如,在LCMS中,掃描前體離子時,遇到這種情況,甚至不知道哪個峰才是目標物;
3.當(dāng)標樣和樣品的溶劑不一致時,保留時間不吻合,同樣危害定性;比如酒類成分分析,標樣溶于純水,樣品是過濾的酒,后者的溶劑就是乙醇水,它的保留時間必定早于純水溶解的標樣;再比如水中污染物分析,目標物溶于有機相得到標樣,而樣品是過濾后的天然水;
4.強洗脫的溶劑在基質(zhì)中提取出的雜質(zhì)遇流動相會析出,堵塞針座、柱前管路或色譜柱。
PART 04 應(yīng)該怎樣解決“它”?
1.溶劑強度
對于這一最普遍的溶劑效應(yīng),解決辦法即調(diào)整稀釋劑或流動相,使二者洗脫能力接近,或稀釋劑洗脫能力稍低于流動相都是可以的。一般情況下,為避免溶劑強度差異導(dǎo)致的溶劑效應(yīng),反相色譜中較為穩(wěn)妥的做法是稀釋劑中有機相比例和流動相相當(dāng),必要時可略高于流動相,但應(yīng)當(dāng)據(jù)其評估其溶劑效應(yīng)風(fēng)險。
2.進樣體積
常規(guī)情況下,為了保證峰形,我們的進樣體積都控制在5-20μL,盡量不要超過25μL。如果不能做到減少至合適的進樣體積,為了得到較好的峰形,應(yīng)盡量選擇與流動相比例相同或接近的溶劑。
3.溶劑與流動相的兼容性
使得溶劑與流動相能較好地兼容,目前辦法有兩個:
a.若流動相或流動相中的有機相無法直接溶解樣品,則用可以溶解樣品的溶劑溶解成高濃度儲備液,然后用流動相稀釋至所需濃度;
b.在流動相中加入同樣的助溶劑或表面活性劑,或提高有機相的比例。
4.電離狀態(tài)
電離狀態(tài)的差異許多情況下會表現(xiàn)為保留時間的漂移或不穩(wěn)定。可以通過將樣品溶液的pH調(diào)節(jié)至與流動相一致,或增大流動相的緩沖能力來改善。
5.柱前管路
對于梯度洗脫而言,在不影響分離度的情況下,可以改用較粗內(nèi)徑的柱前管路。(注意:若是等度洗脫,此方法會降低柱效;若是梯度洗脫,基本不影響柱效)。
以上便是本期液相色譜種“溶劑效應(yīng)”的全部內(nèi)容。高效液相色譜進樣前,必須選擇一種合適的溶劑體系,若溶劑選擇不當(dāng)會使得峰形發(fā)生不同程度的異常,進而影響分析結(jié)果。