摘要:
蛋白−蛋白相互作用 (PPIs) 在調(diào)節(jié)機(jī)體生命活動(dòng)中起著決定性的作用, 是體內(nèi)眾多信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵機(jī)制, 其中很多關(guān)鍵蛋白質(zhì)是可以利用的潛在藥物靶點(diǎn)。探索有效調(diào)控蛋白−蛋白相互作用的方法, 將對(duì)生理學(xué)以及藥物研究大有裨益。絕大多數(shù)蛋白−蛋白相互作用以相對(duì)較大且較淺的作用面模式進(jìn)行, 小分子難以形成有效結(jié)合或調(diào)控。將蛋白−蛋白相互作用中以多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)為支撐骨架的折疊亞結(jié)構(gòu)域中的 α-螺旋肽單獨(dú)提取出來, 通過化學(xué)合成的方法加以構(gòu)建將有可能得到選擇性作用于靶標(biāo)蛋白的活性多肽藥物先導(dǎo)物。然而大部分多肽片段在離開蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)后將無法穩(wěn)定形成結(jié)合所需的二級(jí)結(jié)構(gòu), 而易于形成無規(guī)則卷曲構(gòu)象從而導(dǎo)致結(jié)合活性下降, 并且更易受肽酶的降解, 無法直接成藥。應(yīng)用全碳骨架形成側(cè)鏈環(huán)合結(jié)構(gòu)改造多肽來穩(wěn)定 α-螺旋肽的活性構(gòu)象, 即訂書肽 (stapled peptide), 成為克服這一缺陷的最直接最有效方法。該方法不僅可以提高其原本的蛋白結(jié)合活性, 而且具有較高的代謝穩(wěn)定性和細(xì)胞膜通透性�；谶@些顯著的優(yōu)勢(shì), 訂書肽已經(jīng)成為一類重要的活性多肽結(jié)構(gòu)改造方式, 也必將由此形成更多的以蛋白−蛋白相互作用為靶點(diǎn)的新型多肽藥物。本文將著重綜述并討論通過化學(xué)手段合成訂書肽的方法及其藥理活性研究進(jìn)展。
蛋白−蛋白相互作用 (PPIs) 是體內(nèi)眾多信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵機(jī)制之一, 也是近年來藥物研究的熱點(diǎn), 有研究估算人體內(nèi)自身體細(xì)胞中有與疾病相關(guān)的 PPI 作用在 13 萬到 65 萬個(gè)之間[1], 這無疑為研發(fā)治療諸如癌癥、免疫疾病、炎癥、感染等疾病的新型藥物提供了一個(gè)巨大的靶點(diǎn)庫。通過對(duì)蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究表明, 大部分 PPI 是以蛋白質(zhì)間多個(gè)多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)單元以一種多位點(diǎn)的大面積結(jié)合方式 (平均作用面積為 1 500～3 000 Å2) 發(fā)生結(jié)合[2], 往往不具有特定的結(jié)合口袋。這顯著增加了以 PPI 為靶點(diǎn)開發(fā)常規(guī)的小分子藥物難度[3]。隨著單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的治療性單抗藥物有能力以 PPI 為靶點(diǎn), 并已在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗感染等方面取得了巨大的成功。但目前單抗藥物成本高、技術(shù)難度大、藥品價(jià)格高的特點(diǎn), 極大的限制了其廣泛應(yīng)用; 此外單抗作為大分子蛋白很難進(jìn)入細(xì)胞, 很多疾病相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的調(diào)控靠單抗藥物難以實(shí)現(xiàn)[4, 5]。
在蛋白質(zhì)中, α-螺旋是最為普遍的二級(jí)結(jié)構(gòu)單位, 并且在蛋白−蛋白、蛋白-DNA 的相互作用中發(fā)揮極其重要的作用。很多蛋白−蛋白相互作用通過以二級(jí)結(jié)構(gòu)為支撐骨架的折疊亞結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn), 而 α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈?zhǔn)瞧渲凶顬槠毡榈淖饔闷蝃6]。這些 α-螺旋肽的平均長度較短, 因此單獨(dú)構(gòu)建這類 α-螺旋肽并通過化學(xué)合成得到可與靶標(biāo)蛋白發(fā)生選擇性作用的活性多肽藥物是可行的。α-螺旋是氨基酸通過肽鍵形成的具有右手螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽, 螺旋每周包含 3.6 個(gè)氨基酸殘基, 螺距為 0.54 nm。該結(jié)構(gòu)由第i 個(gè)氨基酸肽鍵的 N-H 與第 i+4 個(gè)氨基酸肽鍵的羰基氧形成氫鍵而構(gòu)成的十三元“環(huán)”所穩(wěn)定[7]。由于肽鏈骨架以螺旋的方式繞軸伸展, 其主鏈自由旋轉(zhuǎn)被限制, 但多肽側(cè)鏈可以在外部伸展從而表現(xiàn)出獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 這樣的特性使得 α-螺旋多肽可以在 PPI過程中精確契合所對(duì)應(yīng)的三維結(jié)構(gòu)域。統(tǒng)計(jì)表明參與PPIs 的 α-螺旋片段平均長度較短, 平均為 2 至 3 個(gè)螺旋長度 (或 8～12 個(gè)氨基酸殘基)[8]。然而如果從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中截取該 α-螺旋片段, 直接合成的短肽片段在水溶液中不能保持穩(wěn)定的 α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)并傾向于形成無規(guī)則卷曲[9]。無規(guī)則卷曲構(gòu)象的多肽在與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)需轉(zhuǎn)變?yōu)?α-螺旋構(gòu)象, 根據(jù)結(jié)合自由能計(jì)算公式:
其中熵變(ΔS=ΔSW+ΔSvib−ΔSrt−ΔSint,DSW為水熵,ΔSvib為振動(dòng)熵,ΔSrt為配體的平動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)熵,ΔSint為配體的單鍵旋轉(zhuǎn)熵)。對(duì)于多肽這種主鏈為柔性結(jié)構(gòu)的大分子化合物而言,在與受體結(jié)合前后的單鍵旋轉(zhuǎn)熵ΔSint和平動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)熵ΔSrt的變化是巨大的,所以如果活性多肽不能保持其在與靶標(biāo)的結(jié)合前后的構(gòu)象以及分子內(nèi)氫鍵的穩(wěn)定,其結(jié)合過程將引起很大的熵?fù)p失(ΔS負(fù)值增大),從而導(dǎo)致結(jié)合能ΔG下降幅度變小,生物活性降低。此外這種舒展的構(gòu)象充分暴露肽的酶解位點(diǎn), 增加了肽酶的水解幾率, 導(dǎo)致多肽極易被降解, 生物穩(wěn)定性低, 且不易于穿過細(xì)胞膜[10]。
因此, 探索各種有效的方式穩(wěn)定多肽的 α-螺旋構(gòu)象, 或者以非天然的骨架結(jié)構(gòu)構(gòu)建 α-螺旋肽的模擬物成為化學(xué)生物學(xué)以及多肽藥物化學(xué)研究的熱點(diǎn)[11]。根據(jù) α-螺旋的特點(diǎn), 肽鏈 i, i+4, i+7, i+11 位點(diǎn)上的側(cè)鏈處于螺旋結(jié)構(gòu)同側(cè), 在 i 和 i+4 或 i 和 i+7 之間的側(cè)鏈基團(tuán)上通過交叉偶聯(lián)形成連接橋來穩(wěn)定 α-螺旋的構(gòu)象是一種行之有效的方法, 該方法由于連接橋類似訂書釘將 α-螺旋結(jié)構(gòu)加以固定, 故稱之為訂書肽 (stapled peptide)。Verdine 實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了將 BCL-2 蛋白設(shè)計(jì)改造為具有訂書肽結(jié)構(gòu)的活性片段的研究, 改造后的BCL-2訂書肽片段能參與細(xì)胞內(nèi)的 PPI并且表現(xiàn)出了一定的體內(nèi)生物學(xué)活性[12], 一舉打破了一些科學(xué)家提出的“非成藥性蛋白 (undruggable proteins)”的思維禁錮。隨后國內(nèi)外的課題組也都陸續(xù)開展了訂書肽在癌癥、艾滋病以及細(xì)胞信號(hào)通路方面的研究, 由此 可見, 訂書肽這一新型多肽結(jié)構(gòu)改造方法將對(duì)多肽藥物的研發(fā)以及相關(guān)基礎(chǔ)理論的研究提供一條新穎、便捷、可行的解決方案。為此, 本文綜述了該領(lǐng)域近年來報(bào)道的訂書肽改造的方法、成功實(shí)例以及相關(guān)研究進(jìn)展, 以期為該領(lǐng)域的研究提供參考和借鑒。
目前訂書肽按照橋連結(jié)構(gòu) (訂書橋) 的類型不同可分為兩大類, 其一為以碳−碳偶聯(lián)反應(yīng)形成的全碳鏈訂書橋訂書肽, 另一類為以雜原子作為連接反應(yīng)中心的含雜原子鏈訂書橋訂書肽, 下面將對(duì)該兩者分別進(jìn)行介紹。
1 全碳?xì)滏溣啎牡暮铣杉盎钚愿臉?gòu)物
1.1 全碳鏈訂書肽的合成及結(jié)構(gòu)要素
碳鏈訂書橋特別是烯基訂書橋是合成訂書肽的經(jīng)典方法, 1994 年由 Grubbs 小組報(bào)道了利用其發(fā)現(xiàn)的烯烴關(guān)環(huán)復(fù)分解反應(yīng) (RCM 反應(yīng)) 進(jìn)行多肽的結(jié)構(gòu)改造[13], 該方法主要在合成多肽后通過對(duì)肽鏈 i 和i+4 位的絲氨酸進(jìn)行側(cè)鏈烯丙基醚化衍生再通過RCM 反應(yīng)得到由環(huán)烯基橋穩(wěn)定的a-螺旋肽 (圖 1A)。Verdine 及其團(tuán)隊(duì)在此之后發(fā)展出利用具有末端烯烴側(cè)鏈的非天然氨基酸替換天然多肽中的氨基酸殘基并通過 RCM 反應(yīng)形成環(huán)烯橋 (圖 1B)。該方法解決了 Grubbs 方法中由于在合成多肽后再進(jìn)行烯丙基取代所帶來的對(duì)于多肽側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的限制要求以及液相環(huán)合合成的不便, 并首次提出了“訂書肽改造(peptide stapling)”的概念[11], 并經(jīng)過不斷的發(fā)展和改進(jìn)成為了一種經(jīng)典的普適性多肽改造策略和方法。
1.1.1 環(huán)烯訂書肽及結(jié)構(gòu)要素 如前所述單訂書橋
環(huán)烯訂書肽是一種經(jīng)典的訂書肽形式, 也是對(duì)于訂書肽的合成、結(jié)構(gòu)以及活性報(bào)道最多的研究方向。目前較為成熟的方法是以釕催化劑, 利用烯烴復(fù)分解的關(guān)環(huán)反應(yīng)完成 staple 的構(gòu)建。研究表明, RCM 反應(yīng)能與固相合成多肽策略相匹配, 在室溫下, 數(shù)小時(shí)便可以實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化, 優(yōu)于很多需要長時(shí)間加熱且轉(zhuǎn)化率低下的碳−碳偶聯(lián)反應(yīng)[13, 14]。Staple 的構(gòu)建首先需要在多肽序列中引入兩個(gè)或者兩個(gè)以上具有 α-雙取 代 的非 天 然氨 基酸 作為環(huán)合所 需 的關(guān) 鍵砌 塊(building block)。這些非天然氨基酸的特點(diǎn)在于 α-位的取代基中一般一個(gè)為甲基, 另一個(gè)為鏈烯基 (戊烯基、辛烯基等)。經(jīng)過固相肽合成手段將所需氨基酸進(jìn)行逐一縮合得到目標(biāo)多肽鏈后, 特定位置上相適應(yīng)的兩個(gè)非天然氨基酸殘基的側(cè)鏈 (鏈烯基) 通過 RCM 反應(yīng)發(fā)生分子內(nèi)的烯烴復(fù)分解反應(yīng)脫去一分子乙烯形成大環(huán)烯橋, 由于該環(huán)烯橋像訂書釘一樣鎖住原本構(gòu)象易變的螺旋肽, 所以形象的稱之為訂書肽 (stapled peptide), 而相應(yīng)的該環(huán)烯橋可稱之為訂書橋 (staple)。由于非天然氨基酸的 α-雙取代以及訂書橋的形成, 大幅度提高了 α-螺旋構(gòu)象多肽的穩(wěn)固性[15]。并且一些兩親螺旋多肽分子的穿膜能力也得到了提升, 同時(shí)很大程度上克服了舒張伸展?fàn)顟B(tài)下的多肽鏈易受到肽酶水解破壞的弱點(diǎn)[16]。
1.1.2 關(guān)鍵“砌塊”的構(gòu)建
合成訂書肽的關(guān)鍵砌塊一般是具有α-烯烴側(cè)鏈的非天然氨基酸 (圖2A), 目前的研究主要采用 α-C 的絕對(duì)構(gòu)型為 S 或 R 的手性烯基非天然氨基酸, 簡稱為 Sn 或 Rn (n 為側(cè)鏈烯基中碳的個(gè)數(shù))。此外, 還有用于縫合肽改造的 α-雙烯基取代氨基酸, 如 B5[4]。通過高效、低耗、簡便的有機(jī)合成方法制備上述的關(guān)鍵砌塊是訂書肽合成的必要條件。國內(nèi)外許多課題組以不同策略建立了不對(duì)稱合成手性氨基酸方法, 目前效果較好的方法包括: 以噁嗪酮 (oxazinone) 為手性配體, 通過不對(duì)稱烷基化反應(yīng)合成目標(biāo)化合物[17−19]; 通過手性配體 BPB (benzylprolylaminobenzophenone) 與金屬鎳、丙氨酸 (甘氨酸) 反應(yīng)生成復(fù)合底物, 經(jīng)過手性誘導(dǎo)合成高對(duì)映選擇性的手性氨基酸[20−22]。由于 B5 是非手性氨基酸,合成相對(duì)較為簡便, 可采用 N-二苯亞甲基甘氨酸酯為起始物, 再進(jìn)行甘氨酸酯 α-位兩次烷基化反應(yīng), 最后經(jīng)過酸解、去保護(hù)便可得到相應(yīng)的 α-雙取代氨基酸(圖 2B)。通過上述方法合成得到的游離狀態(tài) Sn、Rn 和B5 與 Fmoc-OSu 或 Fmoc-Cl 反應(yīng)生成相應(yīng)的 Fmoc 保護(hù)的氨基酸后即可參與常規(guī)的 Fmoc 策略多肽合成。
1.1.3 關(guān)鍵“砌塊”的嵌入位點(diǎn)的選擇方法
由于插入的非天然氨基酸使改造后的訂書肽性質(zhì)與天然肽有所差異, 在參與 PPIs 時(shí)所表現(xiàn)出的活性也有不同。為了篩選出理想的高活性訂書肽, Sn、Rn 和 B5 殘基嵌入到多肽序列的位點(diǎn)尤為關(guān)鍵。根據(jù)已報(bào)道的策略, 有兩種方法較為成熟。第一種策略是通過分析目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù), 通過計(jì)算機(jī)輔助模擬優(yōu)化α-螺旋肽片段在 PPIs 中的構(gòu)象, 選擇不參與 PPIs 的氨基酸殘基位作為非天然氨基酸的嵌入位點(diǎn), 而已知的或者是被推測(cè)可能與靶標(biāo)相結(jié)合的氨基酸殘基應(yīng)保持完整, 使構(gòu)建后的訂書橋遠(yuǎn)離結(jié)合面, 以避免在作用表面形成干擾[23]。另一種策略是針對(duì)目標(biāo)肽, 對(duì)其所有能夠改動(dòng)的序列位點(diǎn)進(jìn)行非天然氨基酸的替換, 合成一系列具有不同訂書橋插入位點(diǎn)的訂書肽, 最后通過活性篩選的方法確定最佳的嵌入位點(diǎn)[24]。值得指出的是雖然在一般情況下應(yīng)避免在多肽和受體的作用面處構(gòu)建訂書橋, 但在一些以 α-螺旋中的疏水氨基酸 (如 Val、Leu、Ile) 介導(dǎo)與受體相互作用的情況下, 在作用面?zhèn)葮?gòu)建全碳?xì)滏溣啎鴺蚩梢源媸杷被崆度胧荏w的疏水槽中從而使訂書橋發(fā)揮穩(wěn)定螺旋和參與結(jié)合的雙重功能[25−30]。Speltz 等[31]更進(jìn)一步通過向橋頭氨基酸的烯基側(cè)鏈中引入甲基取代基模擬疏水氨基酸 (圖 2C), 通過對(duì)甲基取代基構(gòu)型的優(yōu)選使得其與受體的結(jié)合能力進(jìn)一步提高。
根據(jù) α-螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn), 完整的螺旋一周有 3.6個(gè)氨基酸殘基, 在此結(jié)構(gòu)中, i, i+4, i+7 和 i+11 位點(diǎn)的側(cè)鏈處于螺旋的同側(cè) (圖 3A)。訂書肽改造策略利用這一特點(diǎn), 通過位于同側(cè)的 α-C 側(cè)鏈進(jìn)行 RCM 反應(yīng)形成環(huán)烯橋。目前, 經(jīng)典的改造方法是在 i, i+4 位點(diǎn)分別以兩個(gè) S 構(gòu)型戊烯基丙氨酸 (S5) 替換原有氨基酸殘基并形成 staple, 從而實(shí)現(xiàn)固定 α-螺旋一周[11](圖 3B); 如用相似的方法在 i, i+7 處形成 staple 則可以固定螺旋兩周, 相應(yīng)兩位點(diǎn)處則需要側(cè)鏈更長的R8 和 S5 或 S8 和 R5 的組合 (圖 3C)。除了上述兩種經(jīng)典方法外, i, i+3 位點(diǎn)也可適用訂書肽改造, 但需要注意的是 staple 的長度具有一定的靈活性: 當(dāng)其為 8 個(gè)碳原子時(shí), 需要 R5 與 S5 的結(jié)合 (圖 3D); 當(dāng)其為 6 個(gè)碳原子時(shí), 則需要 R5與 S3或者 R3與 S5的組合才可以維持合適的多肽構(gòu)象[32, 33]。
2014 年 Verdine 課題組又報(bào)道了令人耳目一新的“縫合肽”(stitched peptides), 巧妙地升級(jí)了原有的訂書肽改造方法。通過將 α 位雙戊烯基取代的非手性氨基酸 B5 引入多肽序列, 其兩側(cè)再各引入一個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)相適應(yīng)的 Sn 和 Rn (如 S5+B5+R5、S5+B5+S8、R8+B5+S8等), 從而在 i, i+4, i+8或 i, i+4, i+11 或 i, i+7, i+14 處以一個(gè)共用中間橋頭的方式形成雙重訂書橋, 猶如穿針引線一般將螺旋肽鏈縫合起來, 從而可以大幅度地提高了訂書肽 α-螺旋性 (圖 3E)[4]。
目前在 i, i+4 位點(diǎn)以 S5+S5 為嵌入砌塊的訂書肽改造方法在國內(nèi)外課題組中應(yīng)用最為廣泛。對(duì)于短 肽來講, 可以通過一個(gè)訂書橋完成 α-螺旋的固定, 如果先導(dǎo)物為長肽, 則可以通過兩個(gè)或者兩個(gè)以上的獨(dú)立 staple 進(jìn)行結(jié)構(gòu)固定 (雙訂書肽, 不同于 stitched peptides)[34]。但是需要注意的是, 以 R5+R5 代替 S5+S5在 i, i+4 位點(diǎn)上進(jìn)行改造的研究則非常少見, 主要因?yàn)橥ㄟ^ R5+R5 的改造不但不能夠提高目標(biāo)肽的 α-螺旋性, 反而會(huì)使其有明顯的下降, 細(xì)胞攝取目標(biāo)肽的能力也隨之減弱[35]。
1.1.4 全碳鏈訂書肽的固相合成
訂書肽的合成與一般的多肽固相合成基本一致, 較為特別的是 Sn 或Rn 在引入時(shí), 由于位阻較大需要如 PyAOP 等較為高效的縮合劑確�？s合反應(yīng)的鏈接效率。由于該 α-雙取代氨基酸的游離氨基無法通過常規(guī)的 Kaiser 茚三酮方法進(jìn)行監(jiān)測(cè), 可在相應(yīng)位置的氨基酸縮合完成后取少量進(jìn)行裂解并采用 LC/MS 方法進(jìn)行確證。為確保RCM 反應(yīng)在單條多肽分子內(nèi)發(fā)生, 環(huán)合反應(yīng)需要利用固相合成的假稀釋效應(yīng)[36]在固相樹脂上進(jìn)行。整個(gè)訂書肽的合成制備過程大致分為肽鏈的合成、側(cè)鏈的 RCM 反應(yīng)、N-端的修飾、載體的切除、訂書肽的純化等幾個(gè)步驟 (圖 4), 已經(jīng)成為較為成熟的方法[37]。
1.2 全碳?xì)滏溣啎牡幕钚愿脑煳镅芯窟M(jìn)展
1.2.1 P53-MDM2/MDMX 相互作用抑制劑
p53基因是一種重要的抑癌基因,與DNA的修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期的調(diào)控等生命過程息息相關(guān)。p53的缺失和突變及相關(guān)蛋白酶體的降解會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生。MDM2及MDMX是p53的主要抑制因子,兩者相互協(xié)同并通過不同的信號(hào)途徑抑制p53的活性。E3泛素連接酶MDM2可與p53蛋白的反激活域結(jié)合,介導(dǎo)p53的泛素化從而降低p53的穩(wěn)定性。MDMX則主要通過與p53的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)結(jié)合,抑制p53對(duì)其下游基因的轉(zhuǎn)錄活性,從而產(chǎn)生抑制作用[38,39]。研究發(fā)現(xiàn),p53-MDM2蛋白間的相互作用時(shí),一段位于p53N端蛋白反激活域的長15個(gè)氨基酸殘基的α-螺旋(LSQETFSDLWKLLPEN)與MDM2的疏水凹槽結(jié)合并調(diào)控其相互作用[40],其中Phe19、Trp23和Leu26是與MDM2相結(jié)合所必須的[30,41]。Verdine課題組[42]利用全碳?xì)鋫?cè)鏈的staple改造策略,通過對(duì)化合物烯基氨基酸引入位置的篩選,結(jié)合對(duì)酸性及堿性氨基酸殘基的替換改變多肽凈電荷以增加穿膜性等策略,合成并篩選出了具有高親和力、高α-螺旋性以及穿膜能力的訂書肽SAH-p53-8(Ac-QSQQTF[R8NLWRLLS5]-QN-NH2(本文為準(zhǔn)確表述訂書肽的改造結(jié)構(gòu)位置,用黑體標(biāo)出替換的非天然烯基氨基酸并用“[…]”表示位于訂書橋大環(huán)內(nèi)的氨基酸序列),其α-螺旋性達(dá)到85%、KD值達(dá)到55nmol·L−1,并可以透過細(xì)胞膜引起腫瘤細(xì)胞凋亡。隨后Verdine課題組[43]深入研究發(fā)現(xiàn)SAH-p53-8還可以有效地抑制MDMX,對(duì)于MDMX的親和力比MDM2高25倍。因此SAH-p53-8有希望作為抑制腫瘤的雙靶向抑制劑進(jìn)行成藥性研究。在隨后的進(jìn)一步優(yōu)化研究中[44],通過噬菌體展示技術(shù)對(duì)該SAH-p53-8先導(dǎo)物序列氨基酸位點(diǎn)突變得到了一條新的具有更高M(jìn)DMX/MDM2親和力的多肽Ac-LTFEHYWAQLTS-NH2,經(jīng)過對(duì)Glu4和Thr11分別采用 R8 和 S5 替換并形成訂書肽以及對(duì) Asn5、Leu10 的殘基位點(diǎn)替換和 C 端結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了訂書肽候選物 ATSP-7041 (Ac-LTF[R8EYWAQCbaS5]SAANH2), 對(duì) MDM2 和 MDMX 與 p53 的結(jié)合抑制常數(shù)(Ki) 分別達(dá)到 0.9 nmol·L−1 和 6.8 nmol·L−1 水平, 在體內(nèi)外均顯示了顯著的腫瘤抑制活性且藥代性質(zhì)良好, 通過對(duì)候選物進(jìn)一步優(yōu)化得到的訂書肽 ALRN- 6924 目前已進(jìn)入 II 期臨床研究階段 (FDA 臨床研究編號(hào) NCT02264613), 有望上市成為首個(gè)訂書肽治療藥物。
1.2.2 BCL-2 蛋白家族的調(diào)控
細(xì)胞凋亡相關(guān) BCL-2蛋白家族分為兩大類, 一類具有抑制細(xì)胞調(diào)亡作用, 如 BCL-2、BCL-XL、BCL-1、MCL-1 等; 另一類可促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 如 BAX、BCL-XS、BAK、BID 等[45]。大量研究發(fā)現(xiàn) BCL-2 的同源結(jié)構(gòu)域 BH3 中的兩親 α-螺旋片段能結(jié)合到由 BH1、BH2 和 BH3 共同形成的抗凋亡結(jié)構(gòu)域的疏水區(qū)中, 從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[46]。Walensky 等[12]通過模擬 BID 的 BH3 區(qū)域 α-螺旋片段 (EDIIRNIARHLAQVGDSNLDRSIW), 設(shè)計(jì)合成了一組具有穩(wěn)定 α-螺旋結(jié)構(gòu)的訂書肽 SAHBs, 其中篩選出了在穿膜能力、結(jié)合能力和激活細(xì)胞凋 亡活性中具有開發(fā)潛力的訂書肽 SAHBA (EDIIRNIARHLA[S5VGDS5]NLDRSIW)。其 KD 值由原形的 269 nmol·L−1 提高至 38.8 nmol·L−1, α-螺旋性為 87.5%; SAHBA 在體外血清中的半衰期由原形的 3.1 h 提高至 29.4 h。隨后 Stewart 等[47]又篩選了 BCL-2 結(jié)構(gòu)域中的一系列具有 α-螺旋結(jié)構(gòu)的片段并改構(gòu)成為訂書肽, 發(fā)現(xiàn) MCL-1 中的 BH3 片段螺旋本身 (KALETLRRVGDGVQRNHETAF) 為單一的 MCL-1 抑制劑。經(jīng)過改構(gòu)的訂書肽 MCL-1 SAHBX 中, MCL-1 SAHBD(KALETLRRVGDGV[S5RNHS5]TAF) 為理想的抑制劑, 其 KD值為 10±3 nmol·L−1 (原形為 245 ±29 nmol·L−1)。目前以該蛋白為靶點(diǎn)的訂書肽類先導(dǎo)化合物處在臨床前研究階段。
1.2.3 其他碳?xì)滏溣啎牡难芯壳闆r
除了上述研究較早并即將成藥的訂書肽類化合物以外, 隨著訂書肽成為多肽藥物研究的熱點(diǎn), 研究發(fā)現(xiàn)了多種調(diào)節(jié)疾病相關(guān) PPIs 的訂書肽藥物先導(dǎo)物。表 1 總結(jié)了目前已報(bào)道的與靶蛋白相互作用確切、具有顯著藥理活性的訂書肽改構(gòu)物的研究情況。
2 其他類訂書肽的合成設(shè)計(jì)及應(yīng)用
在上述采用 RCM 反應(yīng)穩(wěn)定 α-螺旋的訂書肽策略問世之前, 通過側(cè)鏈間的偶連穩(wěn)定多肽 α-螺旋構(gòu)象的工作已有很多報(bào)道, 例如在側(cè)鏈間形成酰胺鍵[101]、偶氮苯[102]、腙[103]、二硫鍵[104]等, 但這些方法改造后的多肽卻并不能稱之為訂書肽, 主要由于它們?cè)谒幋鷮W(xué)性質(zhì)上不如全碳?xì)滏溣啎姆�(wěn)定[105]。近年來也出現(xiàn)了一些新的改造策略, 雖然它們的鏈接環(huán)也有雜原子參與, 但其在穩(wěn)定構(gòu)象、提高活性和藥代穩(wěn)定性方面與經(jīng)典全碳?xì)滏溣啎挠挟惽ぶ? 可以將其歸為廣義的訂書肽改造方法。下文將按照連接橋環(huán)的結(jié)構(gòu)對(duì)其進(jìn)行分類說明。
2.1 三唑橋環(huán)
點(diǎn)擊化學(xué) (click chemistry) 中的 Huisgen-1,3 偶極環(huán)加成[106]反應(yīng)是在銅催化下, 炔基與疊氮基反應(yīng)生成區(qū)域選擇性的 1,4-取代三唑。由于 Click 反應(yīng)具有高反應(yīng)性、選擇性和生物相容性[107−111], 其環(huán)加成產(chǎn)物具有對(duì)蛋白水解酶的穩(wěn)定性[112]等優(yōu)點(diǎn), Cantel等[113]便率先嘗試將該環(huán)加成反應(yīng)應(yīng)用到多肽側(cè)鏈的偶聯(lián)并取得了令人滿意的結(jié)果。該方法在肽鏈的 i, i+4 位點(diǎn)處分別引入了 α-位末端具有炔基和疊氮基的非天然氨基酸, 最后純化的肽鏈在液相中通過 CuSO4與抗壞血酸的催化發(fā)生 click反應(yīng)形成“三唑橋”(圖5)。利用 click 反應(yīng)改造的 PTHrP 肽比其原形肽活性提高了 5～10 倍, 并與酰胺橋改造后的 PTHrP 肽有著相似的生物活性[114]。隨后 Kawamoto 等[115]在設(shè)計(jì)合成 BCL-9 訂書肽時(shí)也應(yīng)用 click 反應(yīng)來構(gòu)建三唑橋, 通過嵌入位點(diǎn)的篩選以及三唑橋長度的變換優(yōu)化出理想的訂書肽。特別是在該肽鏈上引入的雙三唑橋環(huán)使得改造后的訂書肽 α-螺旋含量大于 90%, 最高甚至達(dá)到 99%, 其親和力以及代謝穩(wěn)定性與野生型 BCL9相比都有很大的提高。
相比全碳?xì)滏溣啎? 三唑訂書肽的形成所需要的銅催化劑非常廉價(jià)且毒性較低, 是一種可行性較高的訂書肽構(gòu)建方法, 但目前對(duì)于它在 α-螺旋性以及酶解穩(wěn)定性上改善作用仍需深入研究。
2.2 硫代橋環(huán)
在多肽或者蛋白質(zhì)的修飾改造中,半胱氨酸的衍生化已成為一種必不可少的構(gòu)建方式,也是化學(xué)生物學(xué)研究的重要方法。雖然目前改造半胱氨酸的方法有烷基化、共軛加成、氧化和還原等方法[116,117],在肽鏈上通過側(cè)鏈巰基之間偶連構(gòu)建橋環(huán)來穩(wěn)定 α-螺旋的方法大多局限于形成二硫鍵。然而當(dāng)二硫鍵處于氧化或還原條件時(shí)其性質(zhì)不夠穩(wěn)定。利用其活性巰基與其他代謝相對(duì)穩(wěn)定的連接結(jié)構(gòu)反應(yīng)得到的橋環(huán)比二硫鍵的穩(wěn)定性強(qiáng), 由此也衍生出下述多種新型訂書肽構(gòu)建方法。
2.2.1 硫代甲基聯(lián)苯橋環(huán)
Muppidi 等[118]報(bào)道了利用 4,4'-二溴甲基聯(lián)苯 (Bph) 或 6,6'-二溴甲基-2,2'-聯(lián)吡啶 (Bpy) 作為連接臂, 通過與 i, i+7 位的半胱氨酸側(cè)鏈反應(yīng)形成硫代甲基聯(lián)苯或聯(lián)吡啶橋環(huán) (圖 6)。他們隨后將該改造策略運(yùn)用到具有 p53-MDM2/MDMX 相互作用雙重抑制作用的多肽序列 (LTFEHYWAQLTS) 改造中。由于這段序列中不含有半胱氨酸, 因此將暴露在溶劑側(cè)的 Glu4 和 Thr11替換為半胱氨酸再進(jìn)行橋環(huán)的構(gòu)建。通過活性篩選顯示改構(gòu)后的訂書肽不但 α-螺旋含量和生物活性有改善而且穿膜能力得到了大幅度的提高。
Muppidi 等[119]又運(yùn)用硫代甲基聯(lián)苯策略對(duì) Sticht等[61]報(bào)道的抑制 HIV-1 病毒衣殼的組裝的 CAI 蛋白片段 (ITFEDLLDYYGP) 進(jìn)行改構(gòu), 將溶劑側(cè)的 Glu4和 Gly11 替換為半胱氨酸后進(jìn)行橋環(huán)的構(gòu)建。對(duì)改構(gòu)物活性測(cè)試顯示, 其穿膜能力都有極大的提高, 且在細(xì)胞水平的病毒感染實(shí)驗(yàn)中顯示出高抑制活性。尤 其是篩選出一條既能夠與 HIV-1 衣殼蛋白碳端結(jié)合(KD =17.5 μmol·L−1) 又能與 gp120 蛋白結(jié)合 (KD =7.4 μmol·L−1) 的改構(gòu)訂書肽 (ISF[CELLDYYC]ESGS), 說明其具有抑制衣殼組裝和抑制 HIV-1 病毒的進(jìn)入細(xì)胞的雙重抑制作用。
來自 BH3 蛋白中的多肽 NoxaB-(75−93)-C75A(AAQLLRIGDKVNLRQKLLN) 能夠高選擇性的與Mcl-1 蛋白結(jié)合從而產(chǎn)生抑制 MCL-1 的作用[120]。Muppidi 等[121]為了優(yōu)化多肽 Noxa BH3 的活性, 通過硫代甲基聯(lián)苯橋環(huán)策略, 將 Gln77與 Lys84替換為半胱氨酸 (AACLLRIGDCVNLRQKLLN) 再進(jìn)行 staple 構(gòu)建。隨后對(duì)系列改構(gòu)物進(jìn)行生物活性測(cè)試, 結(jié)果顯示經(jīng)過改構(gòu)后的訂書肽的 α-螺旋含量、穿膜能力以及酶解穩(wěn)定性都有大幅度提高, 而且對(duì) MCL-1 過度表達(dá)的 U937 細(xì)胞有很好的抑制活性。
2.2.2 硫代氟苯橋環(huán)
Spokoyny等[122]以全氟苯或全氟聯(lián)苯為連接結(jié)構(gòu),立體專一性地串聯(lián)起i,i+4位的巰基側(cè)鏈從而形成硫代氟苯橋環(huán)。應(yīng)用此方法進(jìn)行了HIV-1病毒衣殼CAI蛋白片段的改構(gòu)設(shè)計(jì),該方法得到的訂書肽能有效抑制HIV-1病毒的形成,且在結(jié)合能力、穿膜能力以及酶解穩(wěn)定性上都優(yōu)于未經(jīng)過改造的原形肽(圖7)。該方法在一定程度上是對(duì)烯烴復(fù)分解法的補(bǔ)充,且在反應(yīng)的過程中需引入金屬催化劑, 同時(shí)也不需要非常昂貴的非天然烯基氨基酸, 因而合成成本也大為降低。
2.2.3 硫代四嗪橋環(huán)
Brown 等[123]在對(duì)半胱氨酸殘基側(cè)鏈改造時(shí), 通過 3,6-二氯-1,2,4,5-四嗪與巰基發(fā)生取代反應(yīng)后形成硫代四嗪環(huán)來穩(wěn)定 α-螺旋構(gòu)象。硫代四嗪橋環(huán)在光化學(xué)反應(yīng)下可發(fā)生裂解形成硫氰酸酯側(cè)鏈, 之后可在半胱氨酸的作用下復(fù)原成原肽(圖 8)。
2.2.4 巰基−烯點(diǎn)擊反應(yīng)
Wang 等[124]報(bào)道了利用巰基−烯點(diǎn)擊反應(yīng)構(gòu)建訂書肽以及多肽的大環(huán)化。以不同長度的二烯與兩個(gè)肽鏈巰基在 365 nm 光照下室溫反應(yīng), 在 i, i+4 與 i, i+7 位點(diǎn)之間構(gòu)建硫代橋環(huán)的同 時(shí), 對(duì)其他官能團(tuán)有極好的耐受性, 因此可以在氨基酸側(cè)鏈未經(jīng)保護(hù)的狀態(tài)下進(jìn)行反應(yīng) (圖 9)。隨后他 們比較了通過 RCM 反應(yīng)形成的全碳?xì)滏?Axin 訂書肽[60]與應(yīng)用巰基−烯點(diǎn)擊反應(yīng)改構(gòu)訂書肽的 α-螺旋性, 發(fā)現(xiàn)兩者在圓二色譜中具有幾乎一致的 α-螺旋比例。隨后又發(fā)現(xiàn)全碳?xì)滏湹?p53 訂書肽類似物與硫代橋環(huán)構(gòu)建的訂書肽在抑制 p53-MDMX 相互作用時(shí)表現(xiàn)出了相似的抑制活性, 并可選擇性的誘導(dǎo) p53 野生型細(xì)胞的凋亡。該方法能直接用于未保護(hù)的多肽, 同時(shí)也不需要金屬催化劑的使用, 而且這種類似全碳鏈的鏈接臂的使用能夠避免與大體積的芳香基團(tuán)發(fā)生非特異的反應(yīng)。
2.2.5 巰基−炔點(diǎn)擊反應(yīng)
Tian 等[125]報(bào)道了運(yùn)用光引發(fā)的單組分巰基−炔點(diǎn)擊反應(yīng), 高效簡潔在側(cè)鏈未經(jīng)保護(hù)的 α-螺旋肽上構(gòu)建硫−烯橋環(huán)。在肽鏈的 i, i+4位上分別引入戊炔甘氨酸 (M5) 與半胱氨酸, 隨后在 365 nm 的光引發(fā)條件下完成橋環(huán)的構(gòu)建。用該策略對(duì)調(diào)節(jié)雌激素受體−共同激活劑相互作用的 α-螺旋肽進(jìn)行改構(gòu), 通過與全碳?xì)滏湼臉?gòu)后的訂書肽的比較, 顯示硫−烯橋環(huán)訂書肽親脂性變化較大而且細(xì)胞膜毒性較低。硫碳雙鍵為進(jìn)一步的功能化提供了可 能, 同時(shí)也豐富了訂書肽的改構(gòu)方法, 將古老的硫與炔自由基加成反應(yīng)擴(kuò)展到了化學(xué)生物學(xué)的研究中來(圖 10)。
2.2.6 炔烴復(fù)分解反應(yīng)
Cromm 等[126]報(bào)道了將烯烴復(fù)分解 (RCM) 與炔烴復(fù)分解 (RCAM) 反應(yīng)以正交的方式聯(lián)合應(yīng)用于多肽的結(jié)構(gòu)改造中, 其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于除了向目標(biāo)肽中的四個(gè)環(huán)合位點(diǎn) (i, i+3, i+4, i+7) 中的兩處引入烯基氨基酸 (S5) 以外, 在另外兩個(gè)位點(diǎn)處需引入側(cè)鏈為炔基的非天然氨基酸。由于RCM 反應(yīng) (釕催化) 和 RCAM 反應(yīng) (鉬催化) 條件的正交性, 與雙訂書肽[33]相比, 可以選擇性的控制環(huán)合的的位置從而實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)肽拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的控制。作者將該方法應(yīng)用于 GTPase 酶抑制劑的環(huán)肽改造中并得到了活性改善的抑制劑 StRIP3 (圖 11)。需要指出的是雖然作者選取的改構(gòu)活性肽先導(dǎo)物并非 α-螺旋肽, 但該研究作為經(jīng)典訂書肽方法的延伸值得借鑒。
3 總結(jié)與展望
訂書肽通過用側(cè)鏈環(huán)合的方法提高了 α-螺旋肽的構(gòu)象穩(wěn)定性從而極大的提高與靶蛋白的親和力、代謝穩(wěn)定性、穿膜性。訂書肽在藥效、成本以及技術(shù)難度上填補(bǔ)了小分子藥物與單克隆抗體在蛋白−蛋白相互作用為靶點(diǎn)的藥物研究中各自的不足, 已成為獲得以蛋白−蛋白相互作用為靶點(diǎn)的藥物先導(dǎo)物的一種有效途徑。通過對(duì)已有研究的分析可以發(fā)現(xiàn), 目前訂書肽的研究主要集中在兩個(gè)方向, 其一是對(duì)分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的可調(diào)控蛋白−蛋白相互作用的活性 α-螺旋肽采用經(jīng)典的烯基全碳訂書橋策略實(shí)施改造, 該研究方向起步最早且即將形成首個(gè)訂書肽新藥, 證明了訂書肽藥物開發(fā)的可行性; 另一個(gè)方向是在合成方法學(xué)方面采用已有或開發(fā)新的偶聯(lián)反應(yīng)來構(gòu)建具有新結(jié)構(gòu)的新型訂書肽, 該方向也逐漸成為了有機(jī)化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)的交叉研究熱點(diǎn)。但由于活性螺旋肽的獲得非常依賴于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的晶體結(jié)構(gòu)或是分子生物學(xué)的發(fā)現(xiàn), 對(duì)于單獨(dú)從事合成方法學(xué)研究的課題組而言往往采用已有報(bào)道的活性訂書肽作為先導(dǎo)物或是采用無生物學(xué)活性的模型螺旋肽作為研究對(duì)象。訂書肽研究已經(jīng)成為近年來多肽藥物研究的熱點(diǎn), 正如訂書肽研究領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者Walensky 教授所述[127], 該方法對(duì)多肽性質(zhì)的許多革命性改善將使得多肽藥物的研究得到復(fù)興。可以預(yù)見, 隨著訂書肽研究的不斷深入, 在訂書肽結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、合成方法以及新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)方面將不斷有新的研究成果產(chǎn)生, 也必將為抗腫瘤、抗病毒、抗細(xì)菌感染、內(nèi)分泌調(diào)控、診斷試劑等方面的藥物研究提供新的思路和解決方案。
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