摘要:
信號(hào)肽位于分泌蛋白的N端，一般由10~40個(gè)氨基酸殘基組成，并大致分為3個(gè)區(qū)段：①n區(qū)(n-region)為帶正電荷的氨基酸，如賴氨酸和精氨酸；②疏水區(qū)(h-region)由9個(gè)或更多的以中性氨基酸為主組成的疏水核心區(qū)，能夠形成一段L螺旋結(jié)構(gòu)，常見有亮氨酸、異亮氨酸等；③加工區(qū)(c-region)是信號(hào)肽酶切割信號(hào)肽的部位，由極性、小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等)組成。一般認(rèn)為疏水區(qū)氨基酸序列越長(zhǎng)、疏水性越強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌效率就越高，因此疏水區(qū)的長(zhǎng)度及疏水性對(duì)蛋白質(zhì)分泌十分重要[10, 11]。信號(hào)肽結(jié)構(gòu)如圖 1所示。
2.2 信號(hào)肽轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
信號(hào)肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)可分為兩大類: 若某個(gè)蛋白質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)是同時(shí)發(fā)生的,則屬于翻譯-轉(zhuǎn)運(yùn)同步機(jī)制; 如果蛋白質(zhì)從核糖體上釋放后才發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn),則屬于翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。
(1)翻譯共轉(zhuǎn)運(yùn)途徑[13]。核糖體串聯(lián)成聚核糖體，準(zhǔn)備合成蛋白質(zhì)→信號(hào)識(shí)別顆粒(SRP)識(shí)別并結(jié)合在核糖體上→在聚核糖體上，由mRNA開始合成信號(hào)肽→SRP識(shí)別信號(hào)肽并與之結(jié)合，多肽鏈合成暫時(shí)停止→SRP-信號(hào)肽-聚核糖體復(fù)合物與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上SRP受體及核糖體受體結(jié)合→暫時(shí)停止合成的多肽鏈恢復(fù)合成，新生肽鏈隨信號(hào)肽延伸，接著信號(hào)肽被膜內(nèi)側(cè)的信號(hào)肽酶水解，新生肽鏈繼續(xù)延伸，形成有高級(jí)結(jié)構(gòu)的成熟蛋白質(zhì)。翻譯共轉(zhuǎn)運(yùn)途徑如圖 2所示。
(2)翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。特定條件下蛋白質(zhì)在其合成結(jié)束后才開始轉(zhuǎn)運(yùn),采用這種機(jī)制定位的蛋白質(zhì)一般都是可溶性蛋白質(zhì),它們有一段適度疏水的信號(hào)肽序列而使它們?cè)诤铣蓵r(shí)避開了 SRP 的識(shí)別。
3 信號(hào)肽對(duì)抗體蛋白分泌效率的影響
3.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸組成
大量研究表明，對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞而言，信號(hào)肽的疏水核心長(zhǎng)度和疏水性對(duì)于抗體蛋白的分泌效率至關(guān)重要[14, 15]，強(qiáng)疏水性能夠高效引導(dǎo)新生肽的轉(zhuǎn)運(yùn)。有研究表明，在對(duì)全球熱門抗體藥物阿瓦斯汀(Avastin)的重鏈信號(hào)肽疏水核心區(qū)進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)改造后，用新的疏水性較低的信號(hào)肽取代原有信號(hào)肽，由此造成阿瓦斯汀產(chǎn)量降低[16]。此外，研究酵母 PhoA 信號(hào)肽疏水核心Leu與Ala 的比值時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng) Leu／Ala 為 6∶4 時(shí)，前體蛋白分泌加工能力最高，在此比值附近，信號(hào)肽分泌加工能力隨疏水性的增強(qiáng)而提高[17]。
3.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象
信號(hào)肽序列的二級(jí)空間構(gòu)象能夠與mRNA翻譯起始因子相結(jié)合，但過于復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)卻會(huì)引起翻譯阻遏效應(yīng)。研究表明，全人源化抗HBsAg抗體的原信號(hào)肽經(jīng)過優(yōu)化后二級(jí)結(jié)構(gòu)能量從原來的ΔG=－19.7kcal/mol降至ΔG=－15.9kcal/mol，最終優(yōu)化后的輕鏈信號(hào)肽序列蛋白質(zhì)表達(dá)量比原輕鏈信號(hào)肽序列表達(dá)載體高4~8倍[18]。
4 信號(hào)肽序列優(yōu)化策略
研究發(fā)現(xiàn)，許多原核和真核細(xì)胞甚至不同物種間的信號(hào)肽在功能上是通用的，國(guó)外進(jìn)行基因表達(dá)所采用的分泌信號(hào)大致有以下幾種情況:①與表達(dá)蛋白質(zhì)同源的分泌信號(hào)肽;②與宿主表達(dá)細(xì)胞同源的分泌信號(hào)肽;③機(jī)體內(nèi)表達(dá)的分泌蛋白的分泌信號(hào)肽。不同物種間的信號(hào)肽都可以用于某一特定宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)免疫球蛋白[19]。在動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組抗體蛋白時(shí)常用到的信號(hào)肽除了自身所攜帶的信號(hào)肽還包括：①替換高效表達(dá)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列作為重組抗體的信號(hào)肽，如乳蛋白中的酪蛋白或血清白蛋白的信號(hào)肽序列等，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)能在細(xì)胞中被高效分泌；②對(duì)原有抗體信號(hào)肽序列進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)改造；③替換某些病毒的蛋白質(zhì)信號(hào)肽序列。
4.1 替換高效分泌蛋白的信號(hào)肽
當(dāng)所構(gòu)建的細(xì)胞株無法利用自身的天然信號(hào)肽獲得高表達(dá)分泌目標(biāo)抗體時(shí)，利用高表達(dá)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽替代原信號(hào)肽可以提高目標(biāo)抗體的表達(dá)量，往往同一物種的信號(hào)肽比其他物種的信號(hào)肽表達(dá)量要更高[7]。研究表明，α因子信號(hào)肽對(duì)引導(dǎo)小分子質(zhì)量的蛋白的分泌很有效，如表皮生長(zhǎng)因子，單鏈抗體Fv片段等利用α因子信號(hào)肽獲得了較理想的表達(dá)量。Lars等[20]應(yīng)用CHO細(xì)胞證明，與來自不同物種的或天然免疫球蛋白G信號(hào)肽衍生的信號(hào)肽相比，白蛋白和天青殺素的天然信號(hào)肽介導(dǎo)了抗體的最佳表達(dá)。
4.2 改造信號(hào)肽一級(jí)結(jié)構(gòu)
信號(hào)肽一級(jí)結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)功能區(qū)，根據(jù)研究報(bào)道，增加芽孢桿菌信號(hào)肽N端的正電荷或增加信號(hào)肽疏水核心h區(qū)的疏水性或長(zhǎng)度有利于提高信號(hào)肽的加工效率，信號(hào)肽C端氨基酸殘基的缺失使H區(qū)更靠近切割位點(diǎn)，可能有利于蛋白質(zhì)的易位；而增加信號(hào)肽C端的極性，則可能會(huì)使信號(hào)肽的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降低其加工效率[21]。
4.3 考慮宿主密碼子偏愛性
編碼同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子，蛋白質(zhì)合成過程中，同義密碼子的使用概率并不相同，某一物種或某一基因通常傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子，即為密碼子的偏愛性[22, 23]。各種生物的密碼子使用并不是隨機(jī)的，而有一定的偏愛性,在選擇信號(hào)肽時(shí)，應(yīng)考慮到該表達(dá)宿主相應(yīng)的偏愛密碼子，再進(jìn)行信號(hào)肽的優(yōu)化。Valent等使用偏愛密碼子的信號(hào)肽所得目標(biāo)蛋白產(chǎn)量更高，穩(wěn)定性也較天然信號(hào)肽好[23]。Jalah等對(duì)1L-15的天然信號(hào)肽進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，聯(lián)合使用偏愛密碼子，使得1L-15的表達(dá)水平提高了近100倍[24]。
4.4 使用某些病毒表達(dá)載體所帶的信號(hào)肽序列
某些病毒的表達(dá)蛋白是高分泌蛋白，如昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體和丙型肝炎病毒系統(tǒng)表達(dá)外源基因的表達(dá)量高，而且能完成真核基因產(chǎn)物必要的轉(zhuǎn)錄后加工修飾[25]。但是在表達(dá)抗體藥物時(shí)一般不會(huì)使用病毒載體，因?yàn)槠浒踩詿o法得到保障。
5 小 結(jié)
基于信號(hào)肽的功能對(duì)重組抗體分泌具有重要的作用，對(duì)于其的應(yīng)用也越來越廣泛。通過添加一段合適的信號(hào)肽序列來引導(dǎo)重組抗體的分泌不僅可以實(shí)現(xiàn)提高分泌效率和簡(jiǎn)化下游的純化過程，而且對(duì)抗體的穩(wěn)定性和活性都具有積極的作用，當(dāng)然信號(hào)肽序列的選擇和優(yōu)化要根據(jù)不同的蛋白質(zhì)及表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行。目前，高效的信號(hào)肽也正在不斷被研究和挖掘出來[26]。另外，可以利用在線工具進(jìn)行查詢和檢測(cè)信號(hào)肽序列，從基因組中快速地預(yù)測(cè)出信號(hào)肽[27]，結(jié)果的可信度也比較高。例如，使用UTR Tailortech庫(kù)和SignalP及Tatp軟件等來預(yù)測(cè)篩選適合目的蛋白最佳分泌效率的信號(hào)肽[28, 29]。
展望未來，隨著抗體藥物的發(fā)展和進(jìn)步，關(guān)于提高重組抗體的表達(dá)量和穩(wěn)定性的研究會(huì)不斷的深入和發(fā)展，方法也會(huì)越來越多，而基于信號(hào)肽優(yōu)化的方法或策略將會(huì)很好地促進(jìn)上述研究。
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