摘要:
信號肽位于分泌蛋白的N端，一般由10~40個氨基酸殘基組成，并大致分為3個區(qū)段：①n區(qū)(n-region)為帶正電荷的氨基酸，如賴氨酸和精氨酸；②疏水區(qū)(h-region)由9個或更多的以中性氨基酸為主組成的疏水核心區(qū)，能夠形成一段L螺旋結(jié)構(gòu)，常見有亮氨酸、異亮氨酸等；③加工區(qū)(c-region)是信號肽酶切割信號肽的部位，由極性、小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等)組成。一般認為疏水區(qū)氨基酸序列越長、疏水性越強的蛋白質(zhì)分泌效率就越高，因此疏水區(qū)的長度及疏水性對蛋白質(zhì)分泌十分重要[10, 11]。信號肽結(jié)構(gòu)如圖 1所示。
2.2 信號肽轉(zhuǎn)運機制
信號肽介導的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運可分為兩大類: 若某個蛋白質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運是同時發(fā)生的,則屬于翻譯-轉(zhuǎn)運同步機制; 如果蛋白質(zhì)從核糖體上釋放后才發(fā)生轉(zhuǎn)運,則屬于翻譯后轉(zhuǎn)運機制。
(1)翻譯共轉(zhuǎn)運途徑[13]。核糖體串聯(lián)成聚核糖體，準備合成蛋白質(zhì)→信號識別顆粒(SRP)識別并結(jié)合在核糖體上→在聚核糖體上，由mRNA開始合成信號肽→SRP識別信號肽并與之結(jié)合，多肽鏈合成暫時停止→SRP-信號肽-聚核糖體復合物與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上SRP受體及核糖體受體結(jié)合→暫時停止合成的多肽鏈恢復合成，新生肽鏈隨信號肽延伸，接著信號肽被膜內(nèi)側(cè)的信號肽酶水解，新生肽鏈繼續(xù)延伸，形成有高級結(jié)構(gòu)的成熟蛋白質(zhì)。翻譯共轉(zhuǎn)運途徑如圖 2所示。
(2)翻譯后轉(zhuǎn)運機制。特定條件下蛋白質(zhì)在其合成結(jié)束后才開始轉(zhuǎn)運,采用這種機制定位的蛋白質(zhì)一般都是可溶性蛋白質(zhì),它們有一段適度疏水的信號肽序列而使它們在合成時避開了 SRP 的識別。
3 信號肽對抗體蛋白分泌效率的影響
3.1 一級結(jié)構(gòu)氨基酸組成
大量研究表明，對于動物細胞而言，信號肽的疏水核心長度和疏水性對于抗體蛋白的分泌效率至關(guān)重要[14, 15]，強疏水性能夠高效引導新生肽的轉(zhuǎn)運。有研究表明，在對全球熱門抗體藥物阿瓦斯汀(Avastin)的重鏈信號肽疏水核心區(qū)進行一級結(jié)構(gòu)改造后，用新的疏水性較低的信號肽取代原有信號肽，由此造成阿瓦斯汀產(chǎn)量降低[16]。此外，研究酵母 PhoA 信號肽疏水核心Leu與Ala 的比值時發(fā)現(xiàn)，當 Leu／Ala 為 6∶4 時，前體蛋白分泌加工能力最高，在此比值附近，信號肽分泌加工能力隨疏水性的增強而提高[17]。
3.2 二級結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象
信號肽序列的二級空間構(gòu)象能夠與mRNA翻譯起始因子相結(jié)合，但過于復雜的二級結(jié)構(gòu)卻會引起翻譯阻遏效應。研究表明，全人源化抗HBsAg抗體的原信號肽經(jīng)過優(yōu)化后二級結(jié)構(gòu)能量從原來的ΔG=－19.7kcal/mol降至ΔG=－15.9kcal/mol，最終優(yōu)化后的輕鏈信號肽序列蛋白質(zhì)表達量比原輕鏈信號肽序列表達載體高4~8倍[18]。
4 信號肽序列優(yōu)化策略
研究發(fā)現(xiàn)，許多原核和真核細胞甚至不同物種間的信號肽在功能上是通用的，國外進行基因表達所采用的分泌信號大致有以下幾種情況:①與表達蛋白質(zhì)同源的分泌信號肽;②與宿主表達細胞同源的分泌信號肽;③機體內(nèi)表達的分泌蛋白的分泌信號肽。不同物種間的信號肽都可以用于某一特定宿主細胞表達系統(tǒng)中表達免疫球蛋白[19]。在動物細胞表達系統(tǒng)中表達重組抗體蛋白時常用到的信號肽除了自身所攜帶的信號肽還包括：①替換高效表達蛋白質(zhì)的信號肽序列作為重組抗體的信號肽，如乳蛋白中的酪蛋白或血清白蛋白的信號肽序列等，因為這些蛋白質(zhì)能在細胞中被高效分泌；②對原有抗體信號肽序列進行一級結(jié)構(gòu)改造；③替換某些病毒的蛋白質(zhì)信號肽序列。
4.1 替換高效分泌蛋白的信號肽
當所構(gòu)建的細胞株無法利用自身的天然信號肽獲得高表達分泌目標抗體時，利用高表達蛋白質(zhì)的信號肽替代原信號肽可以提高目標抗體的表達量，往往同一物種的信號肽比其他物種的信號肽表達量要更高[7]。研究表明，α因子信號肽對引導小分子質(zhì)量的蛋白的分泌很有效，如表皮生長因子，單鏈抗體Fv片段等利用α因子信號肽獲得了較理想的表達量。Lars等[20]應用CHO細胞證明，與來自不同物種的或天然免疫球蛋白G信號肽衍生的信號肽相比，白蛋白和天青殺素的天然信號肽介導了抗體的最佳表達。
4.2 改造信號肽一級結(jié)構(gòu)
信號肽一級結(jié)構(gòu)中存在3個功能區(qū)，根據(jù)研究報道，增加芽孢桿菌信號肽N端的正電荷或增加信號肽疏水核心h區(qū)的疏水性或長度有利于提高信號肽的加工效率，信號肽C端氨基酸殘基的缺失使H區(qū)更靠近切割位點，可能有利于蛋白質(zhì)的易位；而增加信號肽C端的極性，則可能會使信號肽的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降低其加工效率[21]。
4.3 考慮宿主密碼子偏愛性
編碼同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子，蛋白質(zhì)合成過程中，同義密碼子的使用概率并不相同，某一物種或某一基因通常傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子，即為密碼子的偏愛性[22, 23]。各種生物的密碼子使用并不是隨機的，而有一定的偏愛性,在選擇信號肽時，應考慮到該表達宿主相應的偏愛密碼子，再進行信號肽的優(yōu)化。Valent等使用偏愛密碼子的信號肽所得目標蛋白產(chǎn)量更高，穩(wěn)定性也較天然信號肽好[23]。Jalah等對1L-15的天然信號肽進行優(yōu)化時，聯(lián)合使用偏愛密碼子，使得1L-15的表達水平提高了近100倍[24]。
4.4 使用某些病毒表達載體所帶的信號肽序列
某些病毒的表達蛋白是高分泌蛋白，如昆蟲桿狀病毒表達載體和丙型肝炎病毒系統(tǒng)表達外源基因的表達量高，而且能完成真核基因產(chǎn)物必要的轉(zhuǎn)錄后加工修飾[25]。但是在表達抗體藥物時一般不會使用病毒載體，因為其安全性無法得到保障。
5 小 結(jié)
基于信號肽的功能對重組抗體分泌具有重要的作用，對于其的應用也越來越廣泛。通過添加一段合適的信號肽序列來引導重組抗體的分泌不僅可以實現(xiàn)提高分泌效率和簡化下游的純化過程，而且對抗體的穩(wěn)定性和活性都具有積極的作用，當然信號肽序列的選擇和優(yōu)化要根據(jù)不同的蛋白質(zhì)及表達系統(tǒng)來進行。目前，高效的信號肽也正在不斷被研究和挖掘出來[26]。另外，可以利用在線工具進行查詢和檢測信號肽序列，從基因組中快速地預測出信號肽[27]，結(jié)果的可信度也比較高。例如，使用UTR Tailortech庫和SignalP及Tatp軟件等來預測篩選適合目的蛋白最佳分泌效率的信號肽[28, 29]。
展望未來，隨著抗體藥物的發(fā)展和進步，關(guān)于提高重組抗體的表達量和穩(wěn)定性的研究會不斷的深入和發(fā)展，方法也會越來越多，而基于信號肽優(yōu)化的方法或策略將會很好地促進上述研究。
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