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多肽磷酸化標(biāo)記技術(shù)
瀏覽量:1976 | 2024/3/25 16:10:13
    磷酸化影響著細(xì)胞生命的方方面面。在細(xì)胞中,大概有1/3的的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是通過磷酸化修飾的。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與多種生物學(xué)過程密切相關(guān),如DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等。磷酸化蛋白質(zhì)及多肽的研究可以幫助人們闡述上述過程的機理,進一步認(rèn)識生命活動的本質(zhì)。肽庫生物依據(jù)自身原料優(yōu)勢和技術(shù)優(yōu)勢,可以合成含有磷酸化絲氨酸(pSer)、磷酸化蘇氨酸(pThr)、磷酸化酪氨酸(pTyr)的多肽,并可以提供含有一個,兩個,三個,四個,五個磷酸化位點修飾的高質(zhì)量多肽。

多肽磷酸化標(biāo)記簡介
    磷酸化多肽主要指肽鏈中的Ser、Tyr和Thr殘基的側(cè)鏈羥基被修飾成酸式磷酸酯多肽。磷酸化多肽是研究蛋白質(zhì)磷酸化過程的必不可少的工具,因此研究蛋白質(zhì)及多肽的磷酸化反應(yīng)并確定成熟簡便的合成路線就變得非常重要。目前,多肽的磷酸化修飾方法主要有兩種:

      (1)將適當(dāng)保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中;
      (2)多肽序列在樹脂上合成完后,再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化。

1)將適當(dāng)保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中:

即事先將需要磷酸化的氨基酸(Thr,Ser或Tyr)磷酸化并適當(dāng)保護,然后按照正常SPPS合成流程將磷酸化單體縮合到多肽指定位點。這種方法操作簡便,已經(jīng)成為多肽單位點磷酸化修飾的主要方法。

2)多肽序列在樹脂上合成完后,再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化:

采用將磷酸化單體縮合到多肽中的方法進行磷酸化修飾時,磷酸化的氨基酸由于側(cè)鏈修飾的較大基團產(chǎn)生的位阻而導(dǎo)致難以與肽鏈縮合,并且之后的氨基酸引入都會比較困難,尤其在含有多個磷酸化位點修飾時,合成將變得異常困難,并且最終產(chǎn)物成分復(fù)雜,難以分離,產(chǎn)率極低。

因此,當(dāng)肽鏈中多個位點進行磷酸化時,可以考慮采用將多肽序列在樹脂上合成完后,再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化:其合成過程主要就是在多肽合成結(jié)束之后,選擇性的脫去要標(biāo)記氨基酸的側(cè)鏈保護基,對于Tyr,Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護的氨基酸進行反應(yīng)。

側(cè)鏈保護基在1%TFA/DCM條件下可以定量的脫除。采用這種方法時,可以采用雙芐基亞磷酰胺,四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體,連接到羥基上,然后在過氧酸條件下氧化生成磷;,完成反應(yīng)。

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