合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則
瀏覽量:1034 | 2024/4/26 15:58:32
一、前言
多肽類化合物是一類重要的生物活性分子。20世紀(jì)70年代生物技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用,使多肽等生物技術(shù)藥物的研究進(jìn)展迅速;與此同時(shí),隨著多肽固相合成技術(shù)及高效液相色譜(HPLC)純化、分析技術(shù)等的發(fā)展,合成多肽藥物的開發(fā)也成為藥物研究中的一個(gè)活躍領(lǐng)域。
采用化學(xué)合成方法制備多肽,可以對(duì)天然多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,從而增加多肽與受體的親和力、選擇性,增強(qiáng)對(duì)酶降解的抵抗力或改善藥代動(dòng)力學(xué)特性,甚至由受體的激動(dòng)劑變?yōu)檗卓箘;此外,新技術(shù)的發(fā)展,例如以多肽固相合成和組合化學(xué)為基礎(chǔ)的組合肽庫合成技術(shù),使得在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的多肽化合物成為可能,藥物篩選的效率不斷提高。因此,將會(huì)有越來越多的采用化學(xué)合成方法制備的多肽類化合物成為治療用藥物。
合成多肽藥物是指采用化學(xué)合成方法制備的多肽類藥物。這類藥物的藥學(xué)研究同樣遵循國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)發(fā)布的相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則的一般性要求。但是,由于多肽主要由氨基酸(包括天然氨基酸和非天然氨基酸)構(gòu)成,這使得多肽類藥物在制備方法、結(jié)構(gòu)確證、質(zhì)量研究等方面又有與一般藥物不同的獨(dú)特問題。本指導(dǎo)原則就是在已有的相關(guān)指導(dǎo)原則基礎(chǔ)上,對(duì)合成多肽藥物藥學(xué)研究方面所涉及的特殊問題進(jìn)行分析,結(jié)合國內(nèi)對(duì)多肽藥物研究和評(píng)價(jià)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),提出多肽藥物藥學(xué)各項(xiàng)研究的一般性要求。當(dāng)然,具體品種研究的內(nèi)容與深度還要取決于品種本身的特性。
本指導(dǎo)原則適用于采用液相或固相合成方法制備的多肽藥物。
二、合成多肽藥物藥學(xué)研究的基本考慮
合成多肽藥物藥學(xué)研究的主要內(nèi)容、研究思路、研究方法及一般性的技術(shù)要求與其他類型的化學(xué)藥物基本一致。但是,由于多肽藥物的特點(diǎn),在進(jìn)行藥學(xué)研究時(shí)還應(yīng)注意考慮以下問題。
1、關(guān)于多肽(原料藥)合成工藝選擇的考慮
多肽的化學(xué)合成是有機(jī)合成的一個(gè)非常特殊的分支,目前主要有液相合成和固相合成兩種方法。
液相合成是經(jīng)典的多肽合成方法,一般采用逐步合成或片段縮合方法。逐步合成法通常從鏈的C'末端氨基酸開始,向不斷增加的氨基酸組分中反復(fù)添加單個(gè)α-氨基保護(hù)的氨基酸。片段縮合一般先將目標(biāo)序列合理分割為片段,再逐步合成各個(gè)片段,最后按序列要求將各個(gè)片段進(jìn)行縮合。液相合成的優(yōu)點(diǎn)是每步中間產(chǎn)物都可以純化、可以獲得中間產(chǎn)物的理化常數(shù)、可以隨意進(jìn)行非氨基酸修飾、可以避免氨基酸缺失,缺點(diǎn)是較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等。
固相合成是將目標(biāo)肽的第一個(gè)氨基酸的羧基以共價(jià)鍵的形式與固相載體(樹脂)相連,再以這一氨基酸的氨基為合成起點(diǎn),使其與相鄰氨基酸(氨基保護(hù))的羧基發(fā)生酰化反應(yīng),形成肽鍵。然后讓包含有這兩個(gè)氨基酸的樹脂肽的氨基脫保護(hù)后與下一個(gè)氨基酸的羧基反應(yīng),不斷重復(fù)這一過程,直至目標(biāo)肽形成為止。其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)化了每步反應(yīng)的后處理操作,避免因手工操作和物料轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失,產(chǎn)率較高且能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化等;其缺點(diǎn)是每步中間產(chǎn)物不可以純化,必須采用較大的氨基酸過量投料,粗品純度不如液相合成物,必須通過可靠的分離手段進(jìn)行純化等。
液相合成和固相合成各有優(yōu)缺點(diǎn),應(yīng)根據(jù)合成的實(shí)際需要選擇適合的工藝。一般而言,液相合成法較適于合成短肽;固相合成法更適于合成中、長肽。當(dāng)然,也可以將兩種方法結(jié)合應(yīng)用,比如采用液相方法合成短肽片斷,然后將該片斷應(yīng)用到固相合成中。
無論是液相合成還是固相合成,均是按照設(shè)計(jì)的氨基酸順序,通過定向形成酰胺鍵方法得到目標(biāo)分子。從理論上講這并不復(fù)雜,但實(shí)施起來需要考慮的因素還是比較多。簡(jiǎn)單的羧酸與胺之間形成酰胺鍵,一般是先將羧基轉(zhuǎn)變成一個(gè)活潑的羧基衍生物(如酰氯或酸酐)再與胺作用,或者在反應(yīng)體系中加入縮合劑。但是,氨基酸之間形成酰胺鍵情況則復(fù)雜得多,這是由于每一個(gè)氨基酸既含有氨基,同時(shí)又含有羧基。如果將一種氨基酸的羧基活化,則其可以和同一種或另一種氨基酸分子的氨基反應(yīng);如果將幾種氨基酸混合在一起,加入縮合劑,則只能得到由具有多種不同氨基酸順序的多肽組成的混合物。因此,多肽合成的研究中不僅需要關(guān)注活化方法、偶聯(lián)方法等,更要關(guān)注保護(hù)/脫保護(hù)策略的選擇。
在多肽合成過程中,會(huì)產(chǎn)生一些與目標(biāo)肽結(jié)構(gòu)類似的雜肽,例如因氨基酸消旋化產(chǎn)生的非對(duì)映異構(gòu)體、因部分氨基酸未連接上產(chǎn)生的缺失肽、因肽鍵斷裂產(chǎn)生的斷裂肽等。因此,需要考慮選擇可靠的分離和純化方法使多肽的純度達(dá)到要求。多肽藥物的純化通常采用色譜方法,但在一些情況下,有機(jī)合成中常見的純化方法(例如重結(jié)晶)也可能適用。
2、關(guān)于多肽結(jié)構(gòu)確證研究的考慮
鑒于多肽分子主要是由各種氨基酸構(gòu)成,單純運(yùn)用有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)研究常用的一些方法例如紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜等來解析多肽的結(jié)構(gòu)可能有一定的困難;一般而言,氨基酸組成分析、質(zhì)譜、氨基酸序列測(cè)定等對(duì)其結(jié)構(gòu)確證有重要意義。
氨基酸組成分析可說明多肽的組成是否正確;質(zhì)譜可以提供分子量以及序列信息。上述兩項(xiàng)數(shù)據(jù)除用于證明多肽的結(jié)構(gòu)外,還能在一定程度上反映測(cè)試樣品的純度(是否含有合成雜質(zhì))。氨基酸序列測(cè)定可以直觀地說明氨基酸的連接順序是否正確,對(duì)于說明合成多肽的結(jié)構(gòu)尤其是中、長肽的結(jié)構(gòu)有非常重要的價(jià)值。
在進(jìn)行多肽藥物的結(jié)構(gòu)研究時(shí),應(yīng)注意結(jié)合多肽的合成工藝(包括中間體的結(jié)構(gòu)研究)、多肽的分子大。òńM成多肽的氨基酸數(shù)量和種類)、擬解決的結(jié)構(gòu)問題、各種測(cè)試方法所能提供的結(jié)構(gòu)信息等,綜合考慮選用合適的研究方法。
對(duì)于具有一定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮其活性的多肽,應(yīng)進(jìn)行必要的立體化學(xué)研究。
3、關(guān)于多肽制劑處方工藝研究的考慮
合成多肽藥物制劑研究的總體目標(biāo)和要求與其它類型化學(xué)藥物制劑是一致的,即通過一系列研究工作,保證制劑劑型選擇依據(jù)充分、處方合理、工藝穩(wěn)定、生產(chǎn)過程得到有效控制,并能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
但是,由于多肽藥物的生物活性可能和其空間結(jié)構(gòu)相關(guān),多肽分子中存在大量的酰胺鍵,另外還可能有羧基、羥基、氨基、巰基等較為活潑的基團(tuán),較易水解或降解,因此了解合成多肽藥物的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性對(duì)選擇適宜的劑型和合理的處方、制備工藝有重要作用。
4、關(guān)于多肽藥物質(zhì)量研究的考慮
多肽藥物(包括原料藥和制劑)的質(zhì)量研究的主要項(xiàng)目、相關(guān)檢測(cè)方法建立和驗(yàn)證的要求與其它類型化學(xué)藥物基本一致。
但是,多肽藥物的一些特點(diǎn)在質(zhì)量研究中需要給予充分的考慮,在研究時(shí)需要增加一些特別的考察項(xiàng)目,例如氨基酸組成分析等;對(duì)于一些中、長肽,生物特性例如效價(jià)、免疫原性和抗原活性等也有必要進(jìn)行研究。
此外,由于合成工藝、結(jié)構(gòu)等方面的獨(dú)特性,合成多肽藥物在部分質(zhì)控項(xiàng)目的檢測(cè)方法建立和方法學(xué)驗(yàn)證方面也有一些特殊的考慮。例如,合成多肽原料藥中工藝雜質(zhì)的來源和一般化學(xué)藥物有所不同,其可能的工藝雜質(zhì)如:缺失(不完全)肽、斷裂肽、去酰胺多肽、氨基酸側(cè)鏈的不完全脫保護(hù)所形成的副產(chǎn)物、氧化肽、二硫鍵交換的產(chǎn)物、非對(duì)映異構(gòu)的多肽、低聚物和/或聚合物及合成中所用的毒性試劑和溶劑等。在合成多肽藥物的有關(guān)物質(zhì)檢查方法的研究中需要充分考慮這些可能的工藝雜質(zhì),對(duì)這些工藝雜質(zhì)檢出能力的驗(yàn)證是方法學(xué)驗(yàn)證的重要方面。
5、關(guān)于多肽藥物穩(wěn)定性研究的考慮
由于多肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),這類藥物的穩(wěn)定性相對(duì)較差,引起多肽藥物不穩(wěn)定的原因主要有水解、氧化、外消旋化、二硫鍵的斷裂及重排、β消除、凝聚、沉淀、吸附等。穩(wěn)定性研究應(yīng)根據(jù)多肽藥物穩(wěn)定性的特點(diǎn)合理選擇試驗(yàn)條件、考察項(xiàng)目。
三、合成多肽藥物藥學(xué)研究的主要內(nèi)容
合成多肽藥物的藥學(xué)研究內(nèi)容和一般化學(xué)藥物一樣,主要包括原料藥的制備工藝研究和結(jié)構(gòu)確證研究、制劑的處方工藝研究、質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂、穩(wěn)定性研究等。這些研究內(nèi)容的一般性的技術(shù)要求也和一般化學(xué)藥物基本一致。但是,正如前面所討論的,多肽藥物還有一些特殊的方面需要在研究中予以考慮,以下主要是針對(duì)多肽藥物藥學(xué)研究的特殊內(nèi)容及其技術(shù)要求進(jìn)行討論,這些技術(shù)要求也包括了對(duì)申報(bào)資料內(nèi)容的一些要求。
(一)原料藥制備工藝研究
1、工藝選擇
研究者可以根據(jù)目標(biāo)肽的結(jié)構(gòu)、自身生產(chǎn)條件等考慮選用液相合成或固相合成工藝。但無論采用何種合成工藝,均需要提供化學(xué)反應(yīng)式、工藝流程圖、操作過程等,對(duì)工藝參數(shù)(如投料量、反應(yīng)條件、反應(yīng)試劑)要有詳細(xì)的描述,包括對(duì)于多肽的修飾(例如二硫鍵的形成等)。
2、起始原料、試劑的質(zhì)量控制
(1) 氨基酸及其衍生物
氨基酸及其衍生物作為多肽合成的起始原料,其質(zhì)量對(duì)合成多肽的質(zhì)量有重要影響,因此應(yīng)關(guān)注氨基酸及其衍生物的來源、質(zhì)控方法等。對(duì)于起始原料的質(zhì)量控制應(yīng)足以保證其質(zhì)量的一致性,以最終保證合成的多肽批間質(zhì)量的穩(wěn)定。作為起始原料的氨基酸及其衍生物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一般應(yīng)包括性狀、熔點(diǎn)、比旋度、化學(xué)純度、色譜純度及光學(xué)純度、含量等,其中對(duì)于起始原料的化學(xué)純度和光學(xué)純度的控制尤為重要。
如果使用了特殊的氨基酸或其衍生物,例如經(jīng)過復(fù)雜修飾的非天然氨基酸、采用新工藝合成的氨基酸等,申報(bào)資料中還應(yīng)提供其合成工藝及結(jié)構(gòu)研究的相關(guān)資料。
(2) 樹脂
采用固相合成方法制備多肽,應(yīng)提供樹脂的來源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)報(bào)告,并對(duì)樹脂的摩爾取代系數(shù)、在不同溶劑中的膨脹系數(shù)、所用合成條件下的穩(wěn)定性情況、交聯(lián)度等予以說明。
常用樹脂包括聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺和聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物等,應(yīng)根據(jù)目標(biāo)多肽C末端氨基酸的不同類型(如羧酸型、酰胺型等)選擇特定用途的樹脂,并說明選擇的依據(jù)。
(3) 試劑和溶劑
可以參考《化學(xué)藥物原料藥制備和結(jié)構(gòu)確證研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的基本要求。
3、工藝的過程控制
(1)反應(yīng)終點(diǎn)監(jiān)控
液相合成屬于常規(guī)有機(jī)合成,一般可采用色譜法(如TLC法、HPLC法)監(jiān)測(cè);固相合成偶合反應(yīng)的終點(diǎn)可采用茚三酮法、三硝基苯磺酸(TNBS)法和四氯苯醌等監(jiān)測(cè)。二硫鍵連接的終點(diǎn)可用Ellman試驗(yàn)或HPLC法監(jiān)測(cè)。除上述方法外,其他合適的方法也可以使用。
(2)中間體質(zhì)量控制
對(duì)于液相合成,應(yīng)參照《化學(xué)藥物原料藥制備和結(jié)構(gòu)確證研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》對(duì)中間體的質(zhì)量進(jìn)行控制,特別要對(duì)縮合片段制訂合適的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(例如對(duì)比旋度、熔點(diǎn)和純度等進(jìn)行控制),含有較長序列的中間體還應(yīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究(例如氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、質(zhì)譜、比旋度等)。
對(duì)于固相合成,一般無中間體分離過程。但如果多肽從樹脂上切割后還需進(jìn)行后續(xù)反應(yīng),對(duì)中間體的質(zhì)量也要進(jìn)行相應(yīng)控制,同時(shí)還要進(jìn)行相應(yīng)的結(jié)構(gòu)研究。
4、分離和純化
在多肽合成過程中,會(huì)產(chǎn)生一些與目標(biāo)多肽結(jié)構(gòu)和性質(zhì)類似的雜肽,例如缺失肽、非對(duì)映異構(gòu)體等,隨著肽鏈的增長,可能存在的雜肽數(shù)量也隨之增加。因此,應(yīng)研究合適的純化方法將目標(biāo)肽從雜肽中分離出來。
多肽純化方法的選擇需要綜合考慮多肽和雜肽的肽鏈長短、極性和荷電性、粗品的純度等?捎糜诙嚯募兓姆椒òㄖ亟Y(jié)晶、逆流分布、電泳、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、反相色譜等。目前已上市多肽藥物常見的純化方法是采用凝膠柱脫鹽后,再用制備型高效液相色譜進(jìn)行純化。
對(duì)于選定的純化方法,應(yīng)提供詳細(xì)的驗(yàn)證性資料例如純化前后樣品的代表性色譜圖以說明純化效果。同時(shí)應(yīng)提供詳細(xì)的純化過程和相關(guān)的工藝參數(shù)。純化工藝的研究可結(jié)合質(zhì)量研究中雜質(zhì)分析方法的驗(yàn)證進(jìn)行。
純化后樣品的干燥方法也應(yīng)明確。常用的干燥方法為凍干法,如果多肽對(duì)溫度不敏感,也可采用室溫或高溫干燥。
(二)結(jié)構(gòu)確證研究
多肽結(jié)構(gòu)研究的主要目的是要說明其氨基酸組成和序列是否正確。多肽分子中如有半胱氨酸,應(yīng)明確其狀態(tài)(氧化態(tài)或還原態(tài)),對(duì)含有多個(gè)半胱氨酸的多肽,應(yīng)明確二硫鍵的正確連接位點(diǎn)。對(duì)于某些長肽,可能還需要采用核磁共振、園二色譜等方法對(duì)其空間結(jié)構(gòu)(例如二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu))進(jìn)行研究。
對(duì)于短肽,采用元素分析、紅外光譜、核磁共振譜、氨基酸組成分析、質(zhì)譜等常見方法,有時(shí)就足以說明其結(jié)構(gòu)特征。如果上述測(cè)試取得的信息難以進(jìn)行合理解析和歸屬,應(yīng)進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定。
對(duì)于中、長肽應(yīng)進(jìn)行氨基酸組成和氨基酸序列分析。闡明氨基酸序列的通用方法是Edman降解,這種方法是測(cè)定N端氨基酸的一種化學(xué)方法;基于多種技術(shù)的質(zhì)譜,如快原子轟擊、電噴霧、場(chǎng)解析和激光解析質(zhì)譜,可提供多肽的分子量及其序列信息,是對(duì)Edman降解的很好補(bǔ)充。
中、長肽的結(jié)構(gòu)研究中,盡管紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜等能夠提供的可供分析的信息有限,但在一些情況下,上述研究還應(yīng)考慮進(jìn)行。例如,在可獲得結(jié)構(gòu)確證對(duì)照品時(shí),進(jìn)行上述譜圖的對(duì)比測(cè)定,對(duì)于說明所研制產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)有重要意義;對(duì)于全新結(jié)構(gòu)的多肽,進(jìn)行上述研究,也可為說明多肽結(jié)構(gòu)提供輔助信息,并為質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供信息。
對(duì)于含有20個(gè)以上氨基酸殘基的多肽,如不能直接確定其序列,可根據(jù)多肽分子量大小及氨基酸組成特點(diǎn),使用專一性較強(qiáng)的蛋白水解酶(一般為肽鏈內(nèi)切酶)將多肽裂解成小片段,再分析各小片段的序列。
當(dāng)多肽中含有非天然氨基酸及氨基酸衍生物時(shí),結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)予以證明。此時(shí),應(yīng)在相應(yīng)的研究中,考察這些非天然氨基酸及氨基酸衍生物的色譜行為。
(三)制劑處方工藝研究
了解合成多肽的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性對(duì)選擇適宜的劑型和合理的處方、制備工藝有重要作用。在進(jìn)行多肽藥物的制劑處方工藝研究時(shí),了解原料藥的色澤、pH、pI、比旋度、立體化學(xué)、水分、溶解度、油/水分配系數(shù)、溶劑化或水合狀態(tài)等,特別是原料藥在固態(tài)和/或溶液狀態(tài)下(不同pH)在光、熱、濕、氧等條件下穩(wěn)定性情況等信息是十分必要的。另外,多肽藥物的空間結(jié)構(gòu)與生物活性密切相關(guān),任何導(dǎo)致多肽折疊結(jié)構(gòu)解體或松散以及損害立體結(jié)構(gòu)的因素都會(huì)影響其生物活性,在處方工藝研究時(shí)對(duì)這些因素需要有全面的了解。
1、劑型的選擇
對(duì)于全新結(jié)構(gòu)多肽藥物的劑型開發(fā),或者對(duì)已上市多肽制劑改變劑型時(shí),全面研究并分析藥物的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性對(duì)于選擇合適的劑型是十分重要的。
與其他化學(xué)藥物相比,合成多肽藥物多具有以下特點(diǎn):(1)穩(wěn)定性差,包括存在化學(xué)和構(gòu)象不穩(wěn)定性;(2)易被胃腸道中的蛋白質(zhì)水解酶降解;(3)體內(nèi)生物半衰期短,被快速消除或降解;(4)脂溶性差,不易通過生物屏障等。因此,多肽藥物通常選擇注射途徑給藥,主要?jiǎng)┬蜑閮龈煞坩槃┖妥⑸湟骸?duì)于研究結(jié)果顯示藥物在溶液狀態(tài)下不穩(wěn)定的,不宜選擇注射液等液體劑型。
對(duì)于需頻繁注射給藥的合成多肽藥物,存在患者使用不便、順應(yīng)性差等問題,選擇適宜的非注射給藥途徑也是此類制劑的研究熱點(diǎn),目前研究最多的主要有鼻腔給藥、肺部給藥、經(jīng)皮給藥和口服給藥等。同時(shí),為了減少給藥次數(shù),也可考慮采用緩釋或控釋技術(shù),使藥物在給藥部位緩慢釋放,達(dá)到理想的治療效應(yīng)。
2、處方篩選及工藝研究
合成多肽藥物處方篩選及工藝研究的重點(diǎn)是通過選擇適宜的處方和工藝條件,保證藥物的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性。
處方篩選通常通過選擇適宜的輔料提高制劑的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性。通過前期的研究工作,詳細(xì)了解外界條件(如pH、溫度、光照、氧濃度等)對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響,已基本可以確定引起某一多肽藥物不穩(wěn)定的主要因素。在處方設(shè)計(jì)中,通過使用適宜的輔料來提高多肽藥物制劑的穩(wěn)定性是目前的主要方法,盡管使用添加劑可以提高多肽藥物穩(wěn)定性的機(jī)制還不十分清楚。對(duì)于多肽藥物的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)可能對(duì)藥物生物活性產(chǎn)生直接影響的,選擇適宜的輔料可能會(huì)保證藥物空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。研究中首先需注意多肽藥物和輔料相容性的考察,可參照《化學(xué)藥物制劑研究技術(shù)指導(dǎo)原則》等進(jìn)行。在此基礎(chǔ)上,處方篩選可通過設(shè)計(jì)相應(yīng)的試驗(yàn)進(jìn)行,重點(diǎn)考察不同處方下藥物的有關(guān)物質(zhì)變化和活性的改變。例如,對(duì)于制劑pH變化可能引起多肽凝聚沉淀,使藥物變性失去生物活性的,可以考察不同pH值的系列處方,或添加不同穩(wěn)定劑(如抗氧劑)的處方,在不同條件下降解產(chǎn)物和活性等的變化情況。
多肽藥物生產(chǎn)過程可能會(huì)對(duì)其穩(wěn)定性和制劑質(zhì)量產(chǎn)生影響,這些因素包括pH、熱處理環(huán)節(jié)、凍干環(huán)節(jié)和剪切力、壓力等,需注意對(duì)影響多肽藥物穩(wěn)定性的生產(chǎn)過程因素進(jìn)行深入的研究。由于多肽藥物特殊的理化性質(zhì),無菌制劑一般不采用終產(chǎn)品熱壓滅菌的生產(chǎn)工藝,多數(shù)情況下采用膜過濾的無菌生產(chǎn)工藝。
對(duì)制劑基本項(xiàng)目考察合格的樣品,可選擇兩種以上處方樣品進(jìn)行影響因素試驗(yàn),重點(diǎn)考察藥物物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性,篩選出相對(duì)滿意的處方。同時(shí),制劑處方和制備工藝也需根據(jù)后期臨床試驗(yàn)的需求和臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。
(四)質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1、質(zhì)量研究
(1) 原料藥的質(zhì)量研究
合成多肽原料藥的質(zhì)量研究除參考一般化學(xué)藥物的研究思路進(jìn)行常規(guī)項(xiàng)目的研究外,還應(yīng)根據(jù)合成多肽的結(jié)構(gòu)特征、制備工藝特點(diǎn)和生物學(xué)特點(diǎn)等進(jìn)行針對(duì)性的研究,研究項(xiàng)目一般包括:外觀性狀、理化常數(shù)、鑒別、氨基酸組成分析、水分、反離子含量、純度、有機(jī)溶劑和反應(yīng)試劑殘留量、生物學(xué)安全性檢查、含量和/或活性效價(jià)測(cè)定等。檢測(cè)方法研究和驗(yàn)證的基本思路和要求與已頒布的相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則相一致。
對(duì)于合成多肽藥物,除常規(guī)項(xiàng)目外,理化常數(shù)一般需要關(guān)注其比旋度、等電點(diǎn)(pI)、溶解性(主要為水和緩沖液中)等。
一般而言,多肽藥物的常規(guī)檢查項(xiàng)目與其它化學(xué)藥物相同。此外,與多肽藥物的結(jié)構(gòu)及合成特點(diǎn)相關(guān)的一些檢查項(xiàng)目,例如氨基酸組成分析、反離子(例如三氟醋酸或醋酸根)含量、反應(yīng)試劑殘留量(例如從樹脂上裂解多肽使用了氫氟酸,需要檢查氟化物殘留量)等,則需要在原料藥質(zhì)量研究中予以重視。
相關(guān)肽檢查(或稱有關(guān)物質(zhì)檢查)是反映多肽化學(xué)純度的重要指標(biāo)之一,根據(jù)多肽的理化性質(zhì)、分子大小,可選擇合適的色譜、電泳等方法進(jìn)行。短肽可參考一般化學(xué)藥品有關(guān)物質(zhì)檢查的研究思路選用適宜的方法;長肽的有關(guān)物質(zhì)檢查方法除常見的RP-HPLC外,還可考慮使用高效離子交換色譜(HPIEC)、毛細(xì)管電泳技術(shù)等,非解離條件下的高效分子排阻色譜(HPSEC)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)以及激光散射粒度測(cè)定等技術(shù)可用于聚合體/低聚體的檢查。有關(guān)物質(zhì)檢查的方法學(xué)驗(yàn)證應(yīng)能證明所采用的方法可以有效分離目標(biāo)多肽與工藝雜質(zhì)(例如缺失肽等)、降解產(chǎn)物(例如二硫鍵交換或氧化產(chǎn)物等)、聚合物等。一般應(yīng)考察兩種以上不同原理的方法,高效液相色譜法至少應(yīng)包括一種梯度洗脫方法,并采用多肽粗品和強(qiáng)制降解試驗(yàn)等對(duì)方法的專屬性等進(jìn)行考察、對(duì)比,此外還應(yīng)注意研究多波長檢測(cè)的結(jié)果并選擇合適的檢測(cè)波長等。
合成多肽因結(jié)構(gòu)特征不同于通常的小分子化學(xué)藥品,純度檢查有時(shí)難以從根本上有效控制產(chǎn)品安全性,需要進(jìn)行必要的生物學(xué)安全性檢查(如過敏試驗(yàn)、降壓物質(zhì)、升壓物質(zhì)、異常毒性等)以全面控制產(chǎn)品質(zhì)量、保證安全性。此外,根據(jù)產(chǎn)品具體情況,對(duì)于長肽,有時(shí)尚需進(jìn)行免疫原性或抗原活性等生物特性的研究。
含量測(cè)定是評(píng)價(jià)多肽質(zhì)量的重要指標(biāo)之一,理化方法測(cè)定其含量時(shí)稱為“含量測(cè)定”,生物學(xué)方法或酶化學(xué)方法測(cè)定其效價(jià)時(shí)稱為“效價(jià)測(cè)定”。對(duì)于短肽,理化方法測(cè)得的含量可以反映其有效程度時(shí),首選簡(jiǎn)單、通用的含量測(cè)定方法;對(duì)于具有一定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮其活性的多肽,需進(jìn)行生物學(xué)方法或酶化學(xué)方法測(cè)定藥物活性(效價(jià))的研究,包括含量與活性的關(guān)系、相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證等。
(2)制劑的質(zhì)量研究
合成多肽制劑的質(zhì)量研究基本思路和要求可參照《化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過程指導(dǎo)原則》、《化學(xué)藥物制劑研究指導(dǎo)原則》等相關(guān)內(nèi)容,根據(jù)合成多肽的具體特點(diǎn),在原料藥質(zhì)量研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合劑型特點(diǎn)、處方工藝以及臨床使用特點(diǎn),重點(diǎn)研究所用輔料和制劑工藝對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響、制劑輔料和制劑產(chǎn)生的降解產(chǎn)物對(duì)檢測(cè)方法的影響以及與劑型相關(guān)的質(zhì)量要素。研究項(xiàng)目一般亦應(yīng)包括性狀、鑒別、檢查(安全性、均一性、純度要求與有效性指標(biāo)等)、含量或效價(jià)測(cè)定等幾個(gè)方面。
2、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
合成多肽藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂原則、要求與《化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過程指導(dǎo)原則》是一致的。即,在系統(tǒng)的質(zhì)量控制研究基礎(chǔ)上,充分考慮藥品安全、有效、質(zhì)量可控的要求,以及生產(chǎn)、流通和使用等環(huán)節(jié)的影響,確定能夠揭示、控制藥物內(nèi)在品質(zhì)的檢測(cè)項(xiàng)目、分析方法和限度要求,如原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括氨基酸組成、等電點(diǎn)、中長肽的肽圖等。合理可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量以保證臨床用藥的安全性和有效性,并有效地控制藥品批間質(zhì)量的一致性。相關(guān)質(zhì)控項(xiàng)目的限度確定也應(yīng)參考相關(guān)的指導(dǎo)原則,例如對(duì)于有關(guān)物質(zhì)檢查限度的確定可以參考《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、已有國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的品種同時(shí)還可參考《已有國家標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品研究技術(shù)指導(dǎo)原則》等的原則性要求,并結(jié)合產(chǎn)品本身的特性及臨床使用情況,視具體情況而定。
隨著藥物研發(fā)進(jìn)程的深入,研究數(shù)據(jù)積累的不斷豐富、方法學(xué)研究的完善和藥物研究技術(shù)的不斷發(fā)展,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在不同研究階段需要不斷修訂和完善。
(五)穩(wěn)定性研究
合成多肽藥物穩(wěn)定性研究的基本原則應(yīng)遵循《化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》的一般性要求。
與一般化學(xué)藥物相比,多肽藥物的穩(wěn)定性較差。引起多肽藥物不穩(wěn)定的原因主要有水解、氧化、外消旋化、二硫鍵的斷裂及重排、β消除、凝聚、沉淀、吸附等。當(dāng)多肽處于溶液中或高濕下保存時(shí),其降解或聚合的速度會(huì)比干燥條件下大為增加。因此,穩(wěn)定性研究應(yīng)根據(jù)多肽藥物穩(wěn)定性的特點(diǎn)合理選擇試驗(yàn)條件、考察項(xiàng)目。加速試驗(yàn)和長期留樣試驗(yàn)的試驗(yàn)條件應(yīng)依據(jù)藥物對(duì)溫度、濕度和光照等條件的敏感程度考察(影響因素試驗(yàn))基礎(chǔ)上選擇;考察項(xiàng)目除常規(guī)項(xiàng)目(例如原料藥的比旋度、有關(guān)物質(zhì)和含量等)外,根據(jù)具體情況,可能還需要考察其生物活性的變化。
與其他化學(xué)藥物不同,多肽藥物可能具有一定程度的表面活性,有與直接接觸藥品的包裝材料和容器發(fā)生吸附等相互作用的可能,從而引起制劑效價(jià)、生物活性下降。例如有些多肽分子能夠與玻璃表面的硅醇基發(fā)生相互作用。因此,在包裝材料的選擇方面需注意其與多肽藥物相互作用的研究,有些情況下可選擇特殊處理后的包裝容器,如表面經(jīng)硅烷化處理的容器等。
四、名詞解釋
非天然氨基酸:除自然界生物體中存在的氨基酸外,其它由人工合成制備的氨基酸。
反離子:和多肽形成離子對(duì)的帶有相反電荷的離子。
五、著者
《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組