1、綜述：
Cy (Cyanine)系列,也叫菁染料，即花青素系列熒光染料是具有多聚次甲基橋鏈化學結(jié)構(gòu)特點的一類合成熒光染料。Cy染料的次甲基橋鏈（1-7個次甲基）兩端常常連著兩個氮原子，其中一個氮原子帶正電，從而Cy染料形成具有離域正電荷效應(yīng)的介離子化合物。因為這個結(jié)構(gòu)特點，Cy染料的消光系數(shù)（extinction coefficient）非常高。橋鏈長度和兩端的發(fā)色團直接控制著染料的吸收峰和發(fā)射峰值，從而讓Cy系列染料可以覆蓋從紫外到遠紅外的幾乎所有常用熒光譜帶。橋鏈長度和兩端的發(fā)色團直接控制著染料的吸收峰和發(fā)射峰值，從而讓Cy系列染料可以覆蓋從紫外到遠紅外的幾乎所有常用熒光譜帶。菁染料Cy系列常分為脂溶性Cy染料、水溶性Cy染料。
青色素這一類熒光染料相對較少。它從青色素衍生而來，也是其名稱的由來：Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通過其反應(yīng)基團與核酸，多肽和蛋白相連。其中，Cy3 and Cy5 是高消光系數(shù)的染料。特別適用于細胞內(nèi)敏感的多肽定位實驗，也是常用的多肽標記染料之一。關(guān)于青色素這類熒光，Cy5還因為對其周邊電子環(huán)境特別敏感，該特征可用于酶測定。附著蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變會導致熒光發(fā)射產(chǎn)生陽性或陰性變化。此外，Cy3和Cy5還可用于FRET試驗。
2、脂溶性Cy染料
脂溶性Cy染料包括Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7和Cy7.5，其中Cy3，Cy5和Cy7的發(fā)色團是indolenine，而Cy3.5，Cy5.5和Cy7.5的是Benzoindole。Benzoindole僅僅比indolenine多了個苯環(huán)，這多余的一個苯環(huán)讓整個染料吸收峰和發(fā)射峰紅移，從而讓Cy染料系列覆蓋廣泛的熒光譜圖。Cy染料的結(jié)構(gòu)幾乎是對稱的，為了讓染料可標記，這其中的一個發(fā)色團上引伸出一個6碳鏈羧基來活化標記。
雖帶一個正電荷，脂溶性Cy染料的水溶性也比較低。在標記生物分子時（一般在緩沖溶液中），常常需要加入有機溶液（一般5-20%的DMF或者DMSO）助溶。常規(guī)是將染料先溶于有機溶劑中，然后按比例加入到生物分子的水溶液中反應(yīng)，反應(yīng)完成后離心除去沉淀的染料。當然脂溶性Cy染料也可以直接在有機溶劑中直接與有機小分子反應(yīng)，標記小分子或者高分子材料。脂溶性Cy染料也易溶于氯仿，甲醇，THF，乙腈等常規(guī)有機溶劑。
3、水溶性Cy染料：
水溶性Cy染料是在脂溶性Cy染料的發(fā)色團上加入磺酸基團從而大大增加了染料的水溶性，同時還稍微提高了染料的光學穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率，因此水溶性染料更耐受光照，發(fā)出的熒光也稍強一些。
由于磺酸鹽的原因，這類染料的水溶性非常高，在標記反應(yīng)中不需要加入任何有機溶劑助溶，另外標記上去的染料分子由于水溶性好不會聚集，也不會影響被標記大分子的穩(wěn)定。這點非常重要，特別是當每個目標生物大分子上需要標記多個染料分子，或者目標生物大分子溶解度低，穩(wěn)定性差時。
4、Cy3 (Cyanine 3)
是一種發(fā)橘黃色熒光的花青素熒光染料。Cy3染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別在550 nm和570 nm左右，它的熒光肉眼觀察很明亮，并且對pH不敏感，在共聚焦顯微鏡中可以用532nm（肩峰）或者556nm（頂峰）的激光束激發(fā)，在普通熒光顯微鏡中可以用 TRITC (tetramethylrhodamine) 的濾片觀察，所以在大部分熒光儀器上都可以使用。
5、Cy7 (Sulfo-Cyanine7)
Cy7是一種熒光標記試劑 (Ex=750 nm，Em=773 nm)。Cy7 (Cyanine 7) 是一種近紅外花青素熒光染料，磺化Cy7(Sulfo-Cy7)是它的水溶型，常常統(tǒng)稱為Cy7。由于它的熒光波長(em：~770 nm)恰好處于肌體近紅外窗口 I 的區(qū)域(肌體的血液，體液和在此區(qū)域背景熒光弱，并且長波長光子的穿透性較強)，所以Cy7常常應(yīng)用于小動物活體體內(nèi)成像中。Cy7熒光肉眼不可見，所以在顯微鏡頭下觀察時需要借助CCD相機在成像軟件中顯示。另外近紅外濾片較少見，很多熒光顯微鏡(包括共聚焦顯微鏡)并不配備，但是流式細胞儀(flow cytometry)常常配備有Cy7濾片組，IVIS等小動物成像系統(tǒng)、Odyssey近紅外熒光掃描儀等設(shè)備也配備有。Cy7是常用熒光染料，Cy7可以用來標記核酸，蛋白，抗體，多肽，納米粒等，它是常見的小動物顯影劑之一。
Cy7熒光基(fluorophore)是長鏈多次甲基結(jié)構(gòu)。目前也有一些結(jié)構(gòu)優(yōu)化的Cy7染料，比如利用環(huán)己烯固化多次甲基橋鏈(polymethine)，據(jù)稱可熒光量子產(chǎn)率20%，但是這一結(jié)論目前還存在爭論(Dyes and Pigments, 2013, 99, 275-283)，可能并沒有熒光增果。無論是哪種結(jié)構(gòu)，Cy7及它的衍生物Cy7.5的量子產(chǎn)率都較低，一般都<0.1左右。量子產(chǎn)率偏低是近紅外染料(包括近紅外熒光蛋白)的通病，并且染料波長越長，量子產(chǎn)率越低，比如很多近紅外窗口II染料的量子產(chǎn)率都低于0.01。
普通Cy7的水溶性較低，所以在水相的標記反應(yīng)體系內(nèi)需要使用有機共溶劑，常用有機溶劑包括DMF，DMSO和乙腈等。如需標記的分子對有機溶劑敏感，可選擇磺化Cy7。兩者的光譜性質(zhì)幾乎一致，因此大部分應(yīng)用可相互替換。磺化Cy7水溶性好，可在水相標記反應(yīng)體系中直接使用，不需要有機溶劑助溶，適合標記對有機溶劑敏感的生物分子。另外由于強水溶性加染料分子本身帶電荷，磺化Cy7標記到生物分子表面后不會引發(fā)疏水性聚集，熒光標記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。
6、特點
CY花菁染料的優(yōu)點：
1：菁染料的摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是最高的
2：細胞和組織的自發(fā)熒光在近紅外波段最小
3：更高的特異性和靈敏度
4：光波在近紅外區(qū)段的組織透過性更好
5：染料細胞毒性小 可用于標記抗體 蛋白 細胞。因此CY花菁染料是非常適合做小鼠活體成像的熒光染料
CY花菁染料的缺點：
1：菁染料的熒光量子效率相比其他染料較低，一般是0.1-0.2
2：多川結(jié)構(gòu)的菁染料容易發(fā)生聚集
7、總結(jié)
多肽熒光標記由于沒有放射性，實驗操作簡單。因此，目前在生物學研究中多肽熒光標記應(yīng)用非常廣泛，多肽熒光標記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對于有游離羧基的采用的方法與接多肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。在N端標記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當有一個間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的多肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免在切割的過程中被TFA切割掉。
人們利用利用熒光標記的多肽來檢測目標蛋白的活性，并將 其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
肽庫生物能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標記多肽。
